刘海燕，郭 星，许文涛，3，王洪新，田洪涛，黄昆仑，3，*

（1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品安全实验室，北京100083；3.农业部转基因生物食用安全检验监督测试中心，北京100083；4.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

转基因植物乳杆菌LP590体外耐受性质的研究

刘海燕1，2，郭 星2，许文涛2，3，王洪新1，田洪涛4，黄昆仑2，3，*

（1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品安全实验室，北京100083；3.农业部转基因生物食用安全检验监督测试中心，北京100083；4.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

植物乳杆菌是乳酸菌中的一种，它具有许多适应于工业生产的优良性质。转基因乳杆菌LP590是由植物乳杆菌LP为亲本，插入nisin基因得到的。为了研究转基因植物乳杆菌LP590的体外耐受性质，本实验以LP590作为对照，将LP590对高温（52℃）、低温（4℃）、乙醇（20%）、过氧化氢（2%）、氯化钠（4mol/L）的耐受性进行了研究。研究表明，LP590与LP在4℃和20%乙醇环境中暴露240min，两株菌有相同的耐受性。而LP590比LP更加耐受高温（52℃）、过氧化氢（2%）和氯化钠（4mol/L）。从研究结果可以看出，转基因植物乳杆菌LP590的体外耐受性总体优于LP，这也为从整体上评价转基因微生物提供了依据。

乳酸菌，转基因乳酸菌，体外耐受

乳酸菌是一类应用广泛的微生物，尤其在食品工业中，它添加到食品中产生风味物质，作为发酵剂，在酿酒和乳品生产中更是应用广泛。乳酸菌之所以被广泛应用，是因为它无毒安全，并且具有许多适于工业生产的优良性质，如耐热、耐冷、耐盐、耐受乙醇等［1］。随着转基因技术的发展，为了满足人们的需要出现了转基因的微生物。正是因为乳酸菌的许多优点使它成为食品级的表达载体，使乳酸菌在工业生产中发挥更大的作用［2］。植物乳杆菌（LP）菌株分离于保健品中，以LP菌株为亲本，将抗生物防腐剂的nisin基因插入其中，成为了转基因乳杆菌LP590，目的是使转基因乳杆菌LP590在有生物防腐剂存在时继续发挥益生菌的作用［3-4］。而在转入外源基因后，该菌株LP590的体外耐受性如果受到影响，它的用途会受到极大限制，所以有必要对转基因植物乳杆菌LP590的耐受性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌LP（AS1.2986）、转基因植物乳杆菌LP590（LM0230） 以上两种菌株均由河北农业大学田洪涛老师惠赠；MRS液体复合培养基和MRS琼脂复合培养基 北京陆桥技术公司。

恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；UVIKON XL-172紫外-可见分光光度计 法国SECOMAM公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备 两株菌分别接种在MRS液体培养基中，厌氧培养16h。取培养好的菌液10mL用离心机低速离心，并用无菌生理盐水洗菌2次。将菌体重悬于10mL的生理盐水中制成菌悬液。

分别用无菌生理盐水配制20%的乙醇、15mmol/L的过氧化氢、4mol/L的氯化钠，备用。

1.2.2 菌数的测定 将培养到一定时间的菌液用生理盐水稀释到适当的浓度梯度，然后用MRS琼脂复合培养基涂板培养，24h后计数确定菌数。

1.2.3 温度的耐受性 将装有10mL无菌生理盐水的试管分别放于52℃的水浴锅和4℃的冰水混合物中，取0.1mL菌悬液分别加入其中混匀，保温0、60、120、180、240min。

1.2.4 乙醇、过氧化氢、氯化钠的耐受性 将装有10mL 20%乙醇、15mmol/L的过氧化氢、4mol/L氯化钠的试管放于37℃水浴中，各试管中分别加入0.1mL菌悬液混匀，保温0、60、120、180、240min。在以上各个时间点取0.1mL培养液进行梯度稀释，然后用MRS固体培养基平板厌氧培养16h计数。

1.3 统计方法

以上实验均进行3个平行，所得数据用均数±标准差的形式给出，用T检验检测两组间差异的显著水平，P＜0.05差异有显著性。

2 结果与讨论

2.1 LP和LP590菌株的耐热性

结果见图1。从图中可以看出，LP590比LP菌株有较高的耐热性，暴露240min后LP590菌株还有20%的活菌，而此时LP菌株几乎没有菌存活。

2.2 LP和LP590对低温耐受性

结果见图2。从图中可以看出，2株菌对低温的耐受性相似，都可以较好地耐受4℃低温。

2.3 LP和LP590对20%乙醇耐受性

结果见图3。从图中可以看出，2株菌在暴露于20%乙醇240min后，都有近50%的菌存活，2株菌耐受乙醇的性质相似。

图1 LP和LP590的耐热性

图2 LP和LP590的对低温的耐受性

图3 LP和LP590对20%乙醇的耐受性

2.4 LP和LP590对2%过氧化氢的耐受性

结果见图4。从图中可以看出，与LP菌株相比，LP590菌株对2%的过氧化氢有较好的耐受性，暴露240min后，LP590菌株还有55%以上的菌存活。

图4 LP和LP590对20%过氧化氢的耐受性

2.5 LP和LP590对4mol/L氯化钠的耐受性

结果见图5。从图中可以看出，LP590和LP菌株对4mol/L氯化钠都有较好的耐受性，而LP590的耐受性更好，暴露240min后，活菌数达95%以上。

图5 LP和LP590对氯化钠的耐受性

3 结论

乳酸菌的体外耐受性是衡量它是否适合工业生产的重要指标之一［5］，因为在工业生产中往往会遇到极端的环境条件。比如在酿酒过程会有较高浓度的乙醇环境，在腌制酱菜时盐浓度较高，而制备干粉的喷雾干燥过程中会有较高的温度［3，6-8］。只有能够耐受这些环境条件的乳酸菌才是理想的乳酸菌。从研究结果可以看出，LP590菌株的体外耐受性较好而且总体优于其亲本LP菌株，从耐受性的角度来说转基因菌株LP590具备经受工业生产中极端环境的要求，这一结果也为从整体上研究转基因微生物提供了依据。

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［2］Chou L，Weimer B.Isolation and characterization of acid-and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus［J］.Dairy Science，1999，82：23-31.

［3］WangYY.Study of lacticacid bacteria and expression system［D］.College of Food Science and Technology，Fudan University，2002.

［4］De Vuyst，L Leroy，F.Bacteriocins from lactic acid bacteria：production，purification，and food applications［J］.Microbiology Biotechnology，2007，13：194-199.

［5］Gastro Net Australia，Your digestive system，downloaded from http：//www.gastro.net.au/frame_digestive.htmL on 14.06.2001.

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［7］Klaenhammer TR.Probiotic bacteria：today and tomorrow［J］. Nutrition，2000，130：415-416.

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Study on tolerance to multistresses in vitro for genetically modified Lactobacillus 590

LIU Hai-yan1，2，GUO Xing2，XU Wen-tao2，3，WANG Hong-xin1，TIAN Hong-tao4，HUANG Kun-lun2，3，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，College of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Laboratory of Food Safety，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.The Supervision，Inspectionamp;Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China；4.Institute of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China）

Lactobacillus as lactic acid bacteria has many excellent traits，which meets the needs of industrial production.Genetically modified（GM）LP590 was obtained from LP by inserting into the gene nisin，which can resist nisin and play a role in bio-preservative.To overall assess the safety of GM LP590 and establish an evaluation model in vitro，some useful explorations were carried out.The ability of LP590 to environmental tolerance（52℃，4℃，ethanol，oxygen，and osmotic stresses）were assessed.LP590 had similar tolerance to LP in 4℃and ethano（l20%）within 240min.Notably，LP590 can more tolerate of high temperature（52℃），H2O（22%）and NaC（l4.0mol/L）than LP.The above results indicated that GM LP590 had many good biological characteristics and good prospects for industrial applications.lt was a useful and comprehensive exploration to establish a new evaluation model in vitro for genetically modified micro-organisms.

Lactobacillus；genetically modified Lactobacillus；tolerance in vitro

TS201.2

A

1002-0306（2011）02-0104-03

2010-10-14 *通讯联系人

刘海燕（1977-），女，博士研究生，研究方向：食品营养与安全。

国家转基因生物新品种培育重大专项课题（2008ZX08011-005，2009ZX08011-011B）。