王守法，巢强国，葛 宇，*，成 姗

（1.华东理工大学生物工程学院，上海200237；2.上海市质量监督检验技术研究院，上海200233）

食物致敏原及其检测技术的研究进展

王守法1，巢强国2，葛 宇2，*，成 姗2

（1.华东理工大学生物工程学院，上海200237；2.上海市质量监督检验技术研究院，上海200233）

近年来随着食物过敏发病率的增加，有关食物过敏的研究越来越受人们的重视，食物过敏已成为当前食品安全领域较为突出的问题。介绍了食物致敏原的性质、种类，详细论述了两类主要的食物致敏原检测技术，并对食物致敏原检测技术的发展趋势和应用前景进行了展望。

食物致敏原，食物过敏，食品检测

食物中能使机体产生过敏反应的物质称为食物致敏原，它们大多是具有酸性等电点的糖蛋白［1］，通常能耐受食品加工、加热和烹调，并能抵抗肠道的消化作用。食物致敏原既有水溶性又有脂溶性，分子量为10～70kDa，无生物化学和免疫化学的共性，也无统一的氨基酸序列，倾向于耐热、耐酸、耐酶解（果蔬致敏原例外）［2］。食物过敏是人们对食物中所含的食物致敏原产生的一种不良反应，在医学上也叫做变态反应。就免疫学机制而言，食物过敏包括4个型的变态反应［3］：I型是IgE介导的超敏反应；II型即细胞毒性超敏反应，由抗细胞表面和组织表面抗原的抗体与补体途径的一些成分及各种效应细胞相互作用，造成这些细胞和组织的损伤；Ⅲ型即免疫复合型超敏反应；Ⅳ型即T细胞介导的迟发性超敏反应，各型可同时存在。从广义的角度来看，食物过敏可分为IgE介导和非IgE介导两大类。

1 食物过敏的现状

近年来食物过敏患者呈现日益增多的趋势，流行病学研究显示［4］，约33%的过敏反应由食物诱发，食物过敏已成为重要的食品安全问题，引起了广泛的关注。据调查［5］，在美国约有2%～2.5%人（600万～700万）经历过食物过敏，婴幼儿发生率约4%～6%，儿童和成人约1%～2%。在英国，食物过敏反应的发生率成人为1.4%～1.9%，儿童为5%，大约有1000万人发病，其中100万人反应严重［6］。荷兰白种人食物过敏发生率成人为1.4%，儿童为5%～7%［7］。重庆医科大学儿童医院在一年内对314名2岁以下儿童进行了食物过敏流行病调查，确诊的食物过敏发病率为5.2%［8］。

过敏性疾病影响全世界近四分之一的人口，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。其中对食物的不良反应备受人们关注，大约30%的成年人在一生中至少有一次以上对食物不良反应的经历，20%～65%的过敏性肠道综合症和消化不良患者的病因与食物过敏有关［9］。目前尚无行之有效的方法治疗食物过敏症，而唯一公认的有效方法是避免食用会导致过敏的食物。因而就当前情况而言，充分认识可能导致过敏的食物并有效检测出患者对何种食物会过敏就显得尤为重要。

2 食物致敏原的种类

在致敏食物中，根据人们对不同的致敏原发生过敏机率的不同，可分为主要致敏原和次要致敏原成分，大多数过敏症患者对主要致敏原敏感。据报道，有8类食物经常引起过敏反应，占所有食物致敏原的90%以上［5］，它们分别为蛋、牛奶、鱼类、甲壳类水产动物、花生、大豆、核果类食物及小麦。表1列出了几种常见食物中毒致敏原成分。

表1 食物中常见的几种蛋白致敏原［16］

表2 两类致敏原检测方法的比较

2.1 蛋类及其制品

鸡蛋是儿童食物过敏反应最常见的原因之一，其阳性率在儿童食物过敏中达35%，而成人过敏也高达12%。蛋白的主要致敏原为卵类黏蛋白Gal d 1、卵白蛋白Gal d 2、卵传铁蛋白Gal d 3和溶菌酶Gal d 4；蛋黄的主要致敏原为卵黄蛋白。据报道［10］，在鸡蛋过敏反应中，蛋白比蛋黄更易引起过敏，卵类黏蛋白为主要致敏原。

2.2 牛奶与奶制品

小于2岁的儿童的牛奶过敏率为1.6%～2.8%，50%～90%的儿童在6岁前转为耐受［11］。牛奶主要致敏原为酪蛋白Bos d 8、β-乳球蛋白Bos d 5、α-乳白蛋白Bos d 4、牛血清白蛋白Bos d 6，其中酪蛋白的免疫原性与抗原性最强。牛奶致敏原相对稳定，在常规处理后可保持其免疫原性。

2.3 甲壳类动物及其制品

随着海产品受到越来越多人的青睐，这类食物过敏反应的报道也逐渐增多。其中，虾致敏原备受关注，据报道0.6%～2.8%的过敏性疾病患者对虾过敏。人们在虾肉中检测出至少13种IgE结合蛋白，但原肌球蛋白被鉴定为唯一的主要致敏原，相对分子质量介于34000～39000之间。据报道，原肌球蛋白是虾、蟹、牡蛎、乌贼等无脊椎动物的重要抗原，具有高度保守的氨基酸序列［12］。

2.4 花生及其制品

由于花生过敏反应的严重性及高发性，使得该致敏原引起医疗机构的广泛关注。据报道食物诱导的过敏反应中，花生过敏占10%～47%［13］。主要花生致敏原为Ara h 1和Ara h 2，其他相关致敏原有Ara h 3和Ara h 4；次要致敏原有Ara h 6、Ara h 7及肌动蛋白。经ELISA抑制实验证实Ara h 2是引起花生与榛子、杏仁等交叉反应的主要致敏原［14］。不同的食物处理方式对花生致敏原有不同影响，烘烤会提高Ara h l的含量，且使IgE抗体结合表位更易与抗体结合［15］。虽然花生与豆科植物有交叉反应蛋白，但临床交叉反应却不多见。花生过敏多见于对蛋、奶、核桃等过敏的个体，但并未发现其与核桃有交叉反应的致敏性蛋白。多数情况下，花生过敏终生存在且容易恶化。

除了主要的几种致敏原之外，不常见的致敏食物有160多种，包括主要粮食、油菜籽、蔬菜作物以及一些加工食品（如啤酒、巧克力等）［17］。另有资料显示，除食物本身成分致敏外，食物中含有的极微量的抗生素（如牛奶中残留的抗生素）、食品添加剂（包括防腐剂、色素、抗氧化剂、香料、乳化剂、稳定剂、膨松剂和保湿剂等）也会导致食物过敏，其中以人工色素、香料引起的过敏反应较为常见［18］。此外，随着生物技术的迅速发展，转基因食品不断进入人类社会，转基因食源性植物中引入了新的致敏原基因，这些人类未知的或从未经人类食用过的成分均可能导致食物过敏。

3 食物致敏原的检测方法

目前在实验室里广泛应用的对食物致敏原的检测方法主要集中在两个方面，即基于蛋白质水平和基于DNA水平。由于这两种方法的机理不同，且各有优缺点，目前两种方法的研究和应用都在同时进行，表2对这两种方法的主要参数进行了比较。

3.1 基于蛋白质的检测方法

由于食物致敏原几乎无一例外都属于蛋白质，因而蛋白质作为其主要的分析物也具有针对性。基于蛋白质的分析方法可以分为两类：免疫分析方法和蛋白分离方法。免疫分析方法（如ELISA）因其具有高特异性及灵敏度的抗体而被多数实验者采用，并被应用于食品工业实验室和官方的食品控制机构来检测和定量食物中存在的致敏原。蛋白分离方法（如质谱法）多数是根据蛋白质大小的多样性来确定致敏蛋白。

3.1.1 酶联免疫法（ELISA） 酶联免疫吸附分析法在致敏原的分析中尤其受欢迎。由于ELISA技术具有较强的特异性和灵敏度，且检测限和定量限低至ppm，使之成为致敏原检测和定量的简单方法，可以进行相对快速和高通量的分析。它被广泛应用于食品工业实验室和官方食品控制机构以检测和定量分析致敏性食物或商品。目前，用于检测谷物、冰淇淋和巧克力中的花生和榛子的ELISA试剂盒已得到了AOAC和欧盟联合研究中心的认证［19］。

3.1.2 横向流动检测（LFT） 横向流动检测（Lateral Flow Test）也叫做横向流动免疫色谱分析（Lateral Flow Immunochromatographic Assays），该方法利用免疫分析的方法快速检测样品或基质中是否含有目标物，常被用于医学诊断妊娠。该方法的检测载体可以分为横向流动试纸和横向流动装置。待测样品经染色后在毛细管作用下沿载体横向流动，在经过测试区域后含有致敏原的样品就会被吸附在检测区域的抗体上而使得检测区域发生颜色反应，通过和对照区域做比较可以判定样品中是否含有致敏原。这种技术非常适合于实验室以外的检测（如对清理后的食品加工生产线进行检测），因为在这些检测中往往需要快速的检测结果且不需或只需对少数的样品进行定量。目前该方法在食品检测中的研究还相对较少，但也有些成功的例子，例如在2009年，Martin Röder等［20］用已有的商业化横向流动装置对曲奇和巧克力中的花生和榛子进行了定量检测，结果表明其检测的灵敏度和检出限都接近于ELISA方法。

3.1.3 质谱法（MS） 由于质谱法具有检测蛋白质的能力，日后它很可能将会被用于确证致敏原。质谱法通过破坏蛋白质以提供序列信息（和基于DNA的检测方法相比，它还可以给出种属的特异性），同时，质谱法对过敏原的检测限接近于ELISA和PCR方法所能达到的水平［21］。质谱实验的高度自动化的特性自然可以使得该方法适用于高通量定量。但正如任何其他新的方法一样，质谱法对食物致敏原分析的应用前景受到设备成本高和缺少专业方法的阻碍。

3.2 基于DNA的检测方法

尽管目前已经开发了很多基于蛋白质的致敏原检测方法，但是由于食品加工过程中往往会采用高温高压等极端条件，使得食品中的致敏原会部分甚至全部变性。这就导致基于蛋白质的检测方法无法得到真实的结果。相对而言，基于DNA的致敏原检测方法（尤其是PCR方法）则是一种更为可靠的方法。无论食品的加工过程多么复杂，只要在食品中提取出微量的致敏蛋白的DNA片断，就可以通过适当的PCR方法进行扩增并对其进行检测。

3.2.1 PCR/实时荧光PCR 当有多个引起过敏的食物需要检测时，如果没有合适的ELISA方法可选，PCR技术则是一个非常值得考虑的方法。同样，在确认含有（或不含）致敏原的食物或商品时，PCR技术也可以对ELISA方法进行验证分析。尽管受到来自于DNA末端残片、残留金属离子、脂肪和蛋白质的干扰作用，用PCR方法检测含有较低水平（低于10ppm）的过敏原DNA含量依然是可行的［22］。

3.2.2 PCR-ELISA PCR-ELISA技术是利用了PCR技术的高敏感性和特异性、探针的特异性、酶标仪直接读取结果的客观性等优点创建的一项技术。它主要由三部分组成，第一部分是聚合酶链式反应（PCR），第二部分是扩增产物与探针的杂交，第三部分即常规的ELISA的抗原抗体反应和酶标显色。早在2002年，Thomas Holzhauser等人［23］就比较了PCR -ELISA法和ELISA法分别检测食品中的致敏原榛子成分，并得出两种方法均适用于检测食物中残留榛子成分的结论。

表2显示，基于蛋白质的食物致敏原检测方法在前处理、耗时、操作等方面优于基于DNA的检测方法，而在稳定性、特异性、检出限等方面则不及基于DNA的检测方法。可以说这两种方法各有千秋，因而在较长的时期内它们将共存而不会替代对方。

除了以上较成熟的两类方法以外，近年来随着人们对食物致敏原的认识和科学技术的发展，生物传感器（Biosensors）、放射变应性吸附法（RAST）、SDS-PAGE免疫印迹法、火箭免疫电泳（RIE）、斑点免疫印迹（Dot Immunoblotting）等多种技术被应用于食物致敏原的研究，使人们对食物致敏原的认识有了很大进步。临床用于检测食物致敏原的方法还有血IGG检测、组胺释放实验、嗜碱性粒细胞活化实验等，但目前尚无哪种方法能检测出所有的食物致敏原，故临床实践中应采取联合使用的方式。

4 总结与展望

致敏原的检测对食物过敏疾病的预防和治疗具有重要的意义。随着各种检测技术的发展，食物致敏原的检测技术有了很大的进步，但也存在一些问题：一些致敏原对实验条件不耐受，容易分解或变性，使得检测结果的准确性和灵敏度受到限制；新型转基因食物的出现会同时带来未知的致敏原，需要一种全新的机制来对其致敏性进行评价；另外，一些坚果类食物、海鲜存在较严重的基质效应，使得食物致敏原检测特异性不是很强。这些都是今后亟需解决的问题。

已公开的各种食物致敏原检测方法都只是针对特定的致敏蛋白，且往往要经过其他方法确证后才具有较强的说服力。所以，不同方法的结合将会是今后食物致敏原检测方法的一个发展方向，这些方法将覆盖免疫学、分子生物学以及生物信息学等多种学科。国外包括 evaller、AllergenOnline在内的一些网站已经建立了致敏蛋白的数据库，可以对蛋白质的致敏性进行评估，甚至可以根据转基因食物的基因序列来评估其致敏性。随着理论和实践研究的不断深入，相信不久人们就会对食物致敏原有更深刻的认识，为今后食物过敏机制的研究、致敏原检测试剂和检测方法的研发提供更坚实的基础。

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Research advances of food allergen and its detection techniques

WANG Shou-fa1，CHAO Qiang-guo2，GE Yu2，*，CHENG Shan2
（1.College of Bioengineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China；2.Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）

With the increasing incidence of food allergy，the study on which is becoming more and more important nowadays.Food allergy is becoming a highlighted problem in the field of food safety now.The characteristics and kinds of food allergens were introduced，two major technologies applied in food allergen detection were elaborated，including protein-based methods and DNA-based methods.And the trends in the development of food allergen detection and its prospect in the food safety determination were also forward commented.

food allergen；food allergy；food determination

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0362-04

2010-03-03 *通讯联系人

王守法（1985-），男，硕士研究生，研究方向：食品安全与检测。