赵喜兰

（漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

桑葚多糖提取、纯化分离及其降糖作用的研究

赵喜兰

（漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

目的：探讨桑葚多糖纯化工艺及降糖作用。方法：AB-8树脂纯化，乙醇醇沉，5%的三氯醋酸的正丁醇+氯仿正丁醇（5∶1）去蛋白，所得多糖经DEAE-纤维素柱分离，所得多糖进行降糖效果测定。结果：实验表明，树脂纯化、乙醇醇沉，5%的三氯醋酸的正丁醇+氯仿正丁醇（5∶1）去蛋白纯化效果较好，DEAE-纤维素柱分离中性多糖P-1，酸性多糖P-2、P-3，且降糖效果明显。结论：该纯化工艺和药理实验为桑葚的综合利用提供了新途径。

桑葚多糖，树脂，乙醇醇沉，去蛋白，降糖

桑葚为桑的聚合果，研究证明，桑中的黄酮和多糖对降血糖具有一定活性作用［1-3］。本研究主要针对桑葚多糖提取、纯化分离工艺和降糖作用进行了研究，为桑葚多糖的进一步开发提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚 漯河农业科学院提供；树脂AB-8 上海试剂四厂；DEAE-纤维素、SepharoseCL-4B、sephadex -G-150 Sigma公司进口分装；四氧嘧啶 Sigma公司；试剂盒 均购自上海科欣生物技术研究所；化学试剂 均为分析纯。

双光束紫外可见分光光谱仪 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑葚多糖的提取 桑葚500g，石油醚回流脱脂lh，抽滤，2000mL蒸馏水100℃提取1h，提取三次，浓缩，醇沉，冷冻干燥，蒸馏水溶解，三氯醋酸（3%）去蛋白，得粗多糖，所得多糖蒸馏水溶解，备用，定量采用苯酚-硫酸法［4］。

1.2.2 AB-8大孔树脂的纯化 取多糖备用液60mL过AB-8树脂，蒸馏水洗脱，流速1mL/min，每管10mL，到无糖为止。

1.2.3 乙醇浓度对醇沉条件的影响 取多糖备用液4份，无水乙醇调成不同浓度的溶液，冰箱静置24h，离心，冷冻干燥，称重。

1.2.4 去蛋白方法的选择 采用传统的Sevage法和3%三氯醋酸法去蛋白，并加以创新：取等体积的5%三氯醋酸的正丁醇溶液与等体积的多糖溶液充分振荡，加入等体积氯仿正丁醇（5∶1），振荡，取水溶液部分，蒸馏水透析。

1.2.5 多糖的DEAE-纤维素柱层析 取精制多糖过DEAE-纤维素柱（OH-），NaCl（0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L）溶液洗脱，流速2mL/min，6mL/管。蒸馏水洗脱得到的中性多糖浓缩到 10mL，上SepHadexG-150柱，用蒸馏水洗脱，流速2mL/min，5mL/管，得中性多糖P-1；0、0.05mol/L NaCl洗脱分别得酸性多糖P-2、P-3。

1.2.6 sepharseCL-B凝胶柱层 取标准葡聚糖系列：T-10、T-30、T40、T-70、T-110进行sepharseCL-B凝胶柱层析，测其洗脱体积（V），做V-lgM的标准曲线，得回归方程y=437.5-79.387x，R=0.986，由样品的体积计算出相应的平均分子量。

1.2.7 中性多糖的气相色谱 样品用硫酸（2N），100℃，12h封管将多糖水解，氢氧化钡中和，过滤水解液，气相色谱分析，以木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖为对照。

1.2.8 降糖作用的研究

1.2.8.1 糖尿病模型的建立 昆明小鼠适应性喂养1周，禁食不禁水 12h，2d腹腔注射2%四氧嘧啶（120mg/kg），72h后形成糖尿病模型，末次注射四氧嘧啶后的4h，测定空腹血糖，血糖值大于11.0mmol/L者为造模成功小鼠［5］。

1.2.8.2 桑葚中性多糖对糖尿病小鼠血糖的影响造模成功的小鼠随机分为5组，分别为：阳性对照，常规饲养；P-1、P-2、P-3阳性治疗阳性对照组分别灌胃P-1、P-2、P-3和常规降糖药物优降糖，蒸馏水2mg/kg，每天两次，阴性对照组常规饲养。第20d小鼠禁食12h，第2d早晨测定血糖含量，断尾取血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度。

2 结果与分析

2.1 AB-8树脂的纯化

1g粗多糖由AB-8树脂纯化后，色素基本去除，极性较弱的有机物去除效率高，最终多糖的纯度达到73.1%，效果较好。

2.2 醇沉条件的选择

实验表明，不同的乙醇浓度所沉淀的多糖量不一样，是由于不同多糖的溶解度在不同浓度的乙醇中是不同的，综合多方面因素，选择80%的乙醇作为醇沉条件。

表1 醇沉条件的选择

2.3 去蛋白方法的选择

从表2中可以看出，第三种方法同Sevga法和3%三氯醋酸法相比，蛋白质的清除率略高于前两种方法，得到多糖的损失率要低很多。

2.4 多糖的分离及分子量的测定

精制多糖上DEAE-纤维素柱，洗脱，根据硫酸苯酚法检测的结果合并相同峰位的组分，减压浓缩至适当体积。其中蒸馏水部分经过SepHadexG-150纯化后得中性多糖P-1，0.05、0.1mol/L的NaCl洗脱得酸性多糖P-2、P-3。sepharseCL-B凝胶柱层析测定分子量分别为121000、45821、46824。

表3 桑葚多糖的降血糖作用

表2 去蛋白方法的选择

2.5 中性多糖的气相色谱

由气相色谱图表明，多糖主要是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖4种单糖组分组成。

图1 中性多糖的气相色谱图

2.6 降糖作用

由表3比较发现，桑葚多糖和优降糖都具有明显的降糖作用，P-1、P-3、优降糖与阳性对照比较，差异极显著，血糖比阳性对照分别降低了66.9%、49.7%、40.6%，相比较而言，P-1降糖作用明显，而P-2差异显著；桑葚多糖与优降糖比较，P-1、P-2差异极显著，而P-3差异显著，说明桑葚多糖的降糖作用明显优于优降糖，其中P-1基本可以维持到正常水平。

3 讨论与结论

3.1 对于多糖的纯化采用了常规的大孔树脂纯化，效果较好，纯度达到73.1%。而对于蛋白质的去除，采取了5%的三氯醋酸的正丁醇+氯仿正丁醇（5∶l）方法，多糖回收率较高，蛋白质的清除率较高，达到93.9%。所得多糖经过DEAE-纤维素柱分离，得到三种多糖，分别为中性多糖P-1，酸性多糖P-2、P-3。

3.2 对所得多糖进行了降糖作用的比较，说明桑葚多糖具有明显的降糖作用，且效果明显，中性多糖基本可以使血糖维持在正常的范围内。

［1］陈福君，卢军，张永煌.桑叶降血糖有效组分对糖尿病动物糖代谢的影响［J］.沈阳药科大学学报，1996，13（1）：24.

［2］廖森泰，邹宇晓，郑祥明.桑宁茶多糖对糖尿病小鼠的降血糖作用研究［J］.蚕业科学，2004，30（3）：327-328.

［3］李先佳，任丽平，王家国.桑叶黄酮和多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠生化指标的影响［J］.中国老年学杂志，2009，29（19）：2536-2537.

［4］陈忠，刘琳玲，何猛雄，等.多糖提取与纯化技术应用进展［J］.食品研究应用与开发，2007，28（3）：186-188.

［5］常慧萍，陶令霞，夏铁骑.南瓜多糖对四氧嘧啶型糖尿病小鼠血糖和血脂的影响［J］.食品科技，2008（6）：247-248.

Study on the purification and hypoglycemic effect of polysaccharide in mulberries

ZHAO Xi-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

Objective：To explore the purification and hypoglycemic effect of polysaccharide in mulberries.Methods：AB-8 resin purification，ethanol precipitation，5%trichloroacetic acid of the n-butanol+chloroform n-butano（l5∶1）to remove protein，polysaccharide obtained was isolated by DEAE-cellulose column separation for hypoglycemic effect test.Results：The tests showed that resin purification，ethanol precipitation，5%trichloroacetic acid of the n-butanol+chloroform n-butanol（5∶1）removed protein absolutely，neutral polysaccharides P-1，acidic polysaccharide P-2，P-3 can be isolated by DEAE-cellulose column separation effectively，the polysaccharide also had remarkable hypoglycemic effect.Conclusion：The technology method provided a new approach for the comprehensive utilization of mulberries.

polysaccharide in mulberries；resin；ethanol precipitation；lustrating protein；hypoglycemic effect

TS255.1

B

1002-0306（2011）02-0259-02

2009-12-28

赵喜兰（1969-），女，副教授，主要从事中药方面的研究。