陈源源，沈 微，石贵阳，王正祥，*

（1.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心，江苏无锡214122）

两种分子标识在酵母分子鉴定中的比较

陈源源1，2，沈 微1，2，石贵阳1，2，王正祥1，2，*

（1.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心，江苏无锡214122）

rDNA序列同源性分析是一种通用的酵母分子鉴定方法，26S rDNA D1/D2区域和rDNA内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）是rDNA序列同源性分析中最为常用的两种分子标识。同时使用这两种分子标识对20株分离自水果表面的酵母菌株进行分子鉴定，结果显示19株酵母分离物的鉴定结果相一致，两种分子标识序列在认定酵母种内和种间关系时都拥有足够的差异，能将大部分酵母菌株直接鉴定到种一级水平。

酵母鉴定，26S rDNA D1/D2区域序列，ITS序列，分子标识

酵母是一类重要的微生物资源，广泛应用于酿酒、酱油、制醋、维生素和食物焙烤等领域，具有重要的工业应用价值。对酵母菌株进行分类鉴定是实现其资源化的基础，传统的酵母鉴定方法主要依靠形态学观察和生理生化实验进行。由于酵母一般以单细胞形式存在，可用于种属鉴定的形态特征较少，因此仅依靠形态观察难以对其进行准确鉴定。而酵母生理生化鉴定方法需要多项实验，完成整个鉴定过程往往需要数周的时间［1］。目前多种分子生物学方法已被用于酵母的分类鉴定，如DNA限制性片段多态性分析（PCR-RFLP）、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）、脉冲电泳核型分析（PFGE）以及核糖体DNA（rDNA）序列同源性分析等［2］。随着 PCR和DNA测序技术的普及，rDNA序列同源性比对分析被广泛用于酵母的分类研究，结合GenBank数据库中大量的rDNA序列信息，可以快速准确地对酵母菌株进行种属鉴定［3-4］。26S rDNA的D1/D2区域序列以及ITS序列是目前酵母分子鉴定中最常用的两种分子标识。一般认为，同种酵母不同菌株之间的26S rDNA D1/D2区域序列的核苷酸差异小于1%，而在不同种酵母之间则存在着较高的差异，因此该区域序列可用于酵母的种属鉴定［5-6］。酵母的ITS序列位于26S和5.8S以及5.8S和18S rDNA之间，属于高度可变的区域，适用于亲缘关系较近的菌株间的分类研究［7-8］。本文提取20株酵母分离物的基因组DNA后，分别扩增其26S rDNA D1/D2及ITS区域序列，核苷酸测序后将测序结果提交至NCBI-BLAST网站进行同源性比对，通过两种分子标识同时对20株酵母分离物进行分子鉴定，以比较两者的鉴定结果及其在分子鉴定中的辨别度差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

研究中使用的20株酵母菌株 分离自新疆和云南的水果样品表面，经反复划线纯化后以甘油管形式保藏于江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心（http：//cicim-cu.jiangnan.edu.cn），编号为CICIM Y1-Y20；Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture和DL-2000 DNA marker 宝生物（大连）有限公司；PCR产物纯化试剂盒 美国OMEGA公司；BigDye Terminator v3.1试剂盒 美国Applied Biosystems公司；其它试剂 国产分析纯；引物 委托上海Sangon公司进行合成；酵母26S rDNA D1/D2区域通用引物序列［9］（pNL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，pNL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）；ITS序列通用引物序列［10］（pITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，pITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

Tprofessional PCR仪 德国Biometra公司；1-15台式高速离心机 德国Sigma公司；Vortex Genius 3振荡器 德国IKA公司；HB100恒温金属浴 杭州博日科技有限公司；水平电泳仪 北京六一厂；Alpha EC凝胶成像系统 美国Alpha Innotech公司；3130基因测序仪 美国Applied Biosystems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及培养条件 将20株待鉴定酵母分离物从甘油保藏管中接出，在YPD培养基平板上划线，30℃培养48h。

1.2.2 酵母基因组DNA的制备 参照文献［11］中的基因组DNA提取方法进行。

1.2.3 26S rDNA D1/D2区域序列和ITS序列的PCR扩增 扩增酵母26S rDNA D1/D2区域序列时，在PCR薄壁管中加入酵母基因组DNA 1μL、10×PCR缓冲液5μL、2.5mol/L dNTP Mixture 4μL、20μmol/L的26S rDNA D1/D2区域序列上下游通用引物各0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，补无菌水至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸1min，经过30个循环后，72℃再延伸10min。

扩增酵母ITS序列时，在50μL PCR反应体系中加入酵母基因组DNA 1μL、10×PCR缓冲液5μL、2.5mol/L dNTP Mixture 4μL、20μmol/L的ITS区域序列上下游通用引物各0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，经过30个循环后，72℃再延伸10min。

扩增结束后取5μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳后使用凝胶成像系统拍照观察。PCR产物纯化参照PCR产物纯化试剂盒说明书进行。

1.2.4 核苷酸序列测定及BLAST比对 核苷酸序列测定参照BigDye Terminator v3.1试剂盒说明书进行。将测序结果用Sequence Scanner V1.0软件进行分析，查看序列的长度及可信度。选择测序结果中可信度高的区域，提交至 NCBI-BLAST网站（http：// blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行比对，得到与该序列同源性最高的菌种名称。

2 结果与讨论

2.1 酵母菌株26S rDNA D1/D2区域和ITS序列扩增结果

电泳PCR产物后发现，20株酵母的26S rDNA D1/D2区域和ITS序列均得到了有效扩增。20株酵母分离物的26S rDNA D1/D2区域序列的大小均在600bp左右（图1）；而不同酵母菌株的ITS序列的大小存在明显差异，介于500～800bp之间（图2），该现象应该与酵母ITS区域不加入成熟核糖体，在进化过程中承受的自然选择压力较小，能容忍更多的序列插入和缺失有关［12］。

图1 20株酵母分离物26S rDNA D1/D2区域序列PCR产物电泳图

图2 20株酵母分离物ITS序列PCR产物电泳图

2.2 核苷酸测序及BLAST比对结果分析

分析测序结果后，选择其中的可信区域序列提交至NCBI网站进行BLAST比对，得到与该序列同源性最高的菌株名称。20株酵母分离物的26S rDNA D1/D2区域序列以及ITS序列的同源性比对结果如表1所示。

表1 两种分子标识对20株酵母菌种的鉴定结果

经BLAST比对发现，26S rDNA D1/D2区域序列和ITS序列对其中19株酵母分离物的鉴定结果一致，且两者在分子鉴定中的辨别度大致相同，能将18株酵母分离物直接鉴定到种。Y10菌株的26S rDNA D1/ D2序列与Candida metapsilosis、Candida orthopsilosis和Candida parapsilosis等3种酵母的26S rDNA D1/D2序列的同源性均为100%，而该菌株的 ITS序列与Candida metapsilosis、Candida orthopsilosis和 Candida parapsilosis的 ITS序列的同源性也均为最高，达到99.09%，两种分子标识都只能将该菌株鉴定到Candida属。

两种分子标识对Y14菌株的鉴定结果不一致，该菌株的26S rDNA D1/D2序列与Candida davisiana MO-Y18菌株26S rDNA D1/D2序列的同源性最高，为100%；而其ITS序列与Sporobolomyces lactosus菌株的ITS序列的同源性最高，为99.80%。上述鉴定差异需要结合其它分子标识以及生理生化实验进行进一步分析研究，以确定该酵母菌株的种属。

研究中还发现，目前DNA测序获得的酵母26S rDNA D1/D2区域及ITS区域的核苷酸序列一般都是直接提交到GenBank数据库进行同源性比对后确定其种属，但由于GenBank数据库对上传的序列信息缺乏有效的验证，导致其中存在着一些不准确甚至是错误的信息［13］。因此在BLAST查询比对时，需要对数据库中的序列进行筛选，应尽量选择已有文章发表的可靠序列进行同源性比对，以保证鉴定结果的可靠性。

3 结论

本文同时利用26S rDNA D1/D2区域以及ITS序列对20株酵母分离物进行分子鉴定，发现这两种分子标识对19株酵母分离物的鉴定结果相同，且两种分子标识序列在认定酵母种内和种间关系时都拥有足够的差异，能将大部分酵母菌株直接鉴定到种一级水平；但两者对Y14菌株的鉴定结果存在差异。因此在进行酵母分子鉴定时，最好能同时使用26S rDNA D1/D2区域以及ITS序列对菌株进行同源性比对分析，综合两种分子标识的比对结果来确定菌株的种属，以增加鉴定的准确性。

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Comparison of two molecular markers in yeast molecular identification

CHEN Yuan-yuan1，2，SHEN Wei1，2，SHI Gui-yang1，2，WANG Zheng-xiang1，2，*
（1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Cultureamp;Information Center of Industrial Microorganism of China Universities，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

rDNA sequence-based alignment and analysis is a widely used method for yeast molecular identification.D1/D2 domain of 26S rDNA and internal transcribed spacer（lTS）belong to the most important molecular markers in yeast identification.Both of these molecular markers of 20 yeast isolates were amplified by PCR assay and compared with alignment sequences in the GenBank databases using the BLAST program.Results showed that 19 out of 20 yeast isolates were consistent between two molecular identification methods，and both of these molecular markers exhibited enough differences between yeasts that it can be used in the discrimination of intra-and inter-species relationships.

yeast identification；D1/D2 domain of 26S rDNA；lTS region；molecular marker

Q789

A

1002-0306（2011）02-0175-03

2010-10-29 *通讯联系人

陈源源（1983-），男，博士研究生，研究方向：微生物资源。

国家自然资源科技平台（2005DKA21208）；教育部科技基础条件平台（505006）。