邓志汇，崔堂兵

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640；2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006）

利用活性真菌转化简单儿茶素为酯型儿茶素

邓志汇1，崔堂兵2

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640；2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006）

研究从茶树的鲜叶、茎部和茶树土壤中分离出活性真菌，通过利用天然微生物的转化能力，使简单儿茶素转化为功能性较强的复杂型酯型儿茶素。实验结果表明：筛选出了具有转化能力的活性菌种，能有效地将简单儿茶素转化为酯型儿茶素，而且其转化能力良好。并对此种活性真菌进行形态学和生理生化的初步检测，判断其属于丝状真菌藻状菌纲，毛霉目，内囊霉科，内囊霉属。

简单儿茶素，酯型儿茶素，活性真菌，生物转化

茶叶中的主要功能成分是儿茶素类，儿茶素包括简单儿茶素和酯型儿茶素。酯型儿茶素是一种具有较强保健功能的物质，是茶多酚的主要成分，约占绿茶儿茶素类总量的10%～15%。它对人类健康有着积极的作用，如抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抑制低密度脂蛋白与血糖上升等功效。由于这些保健功能，酯型儿茶素经济价值比较高。但是目前国内外从茶多酚中提取酯型儿茶素所采用的化学萃取方法存在得率不高、费时、纯度不理想、化学污染大等问题。相比之下，微生物转化法具有微生物资源丰富、种类繁多、底物特异性强的优点。据国内外报道，一些真菌具有一定的生物转化作用，而茶树的茶叶、茎和根部土壤中存在一些内生真菌，能把其他的儿茶素类转化成为酯型儿茶素。因此，本研究拟从茶树根际土壤、树叶和茎中分离得到真菌，以简单儿茶素作为底物在一定条件下转化得到价值较高的酯型儿茶素，从而为制备酯型儿茶素提供一条新的手段［1-3］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿茶 八马铁观音韵香一号品种，福建省安溪；硫酸庆大霉素注射液 广东三才医药集团有限公司；没食子酸、焦性没食子酸 均为分析纯。

薄层层析硅胶板 规格：25mm×75mm，厚度：0.20～0.25mm，青岛海洋化工厂公司；超声波细胞破碎仪 美国SONICS公司；SHP-450D型全自动新型生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；NSKY-200B全温培养振荡器 上海苏坤实业有限公司；QHZ-984恒温摇床 仓市华利达实验设备有限公司；centrifuge 5804R台式超速大型容量离心机 eppendorf。

1.2 实验方法

1.2.1 内生菌的分离及纯化 茶树鲜叶处理：茶树的鲜叶先用75%的酒精清洗，然后用无菌水漂洗5次，把酒精冲洗干净。再把茶叶放进研钵研磨成浆，取1mL的研磨液，加已装有9mL无菌水的试管中，得到10-1的鲜叶样品。再从其中取1mL加入含有9mL无菌水的试管，得到10-2的鲜叶样品。用同样方法制备，得到10-3的茶叶样品［4］。分别向已经制好的PDA培养基中滴入2～3滴硫酸庆大霉素注射液，用接种耙将上述样品均匀涂布至培养基的表面。最后将得到的三个样品采用划斜线分离菌种的方法，接种至含有硫酸庆大霉素的PDA培养基的培养皿之中，28℃培养5～7d。

茶树的茎样品的处理：剪取一段茶树茎部，用75%的酒精清洗，然后用无菌水漂洗5次，把酒精冲洗干净，切成5～6小段。分别向已经制作好的PDA培养基滴入2～3滴硫酸庆大霉素注射液，用接种耙将上述样品均匀涂布至培养基的表面。最后将切分好的小茎分为两份，分别放到含有硫酸庆大霉素的PDA培养基的培养皿之中，28℃培养3～5d。

茶树的根际土壤的处理：首先使其充分溶于含有100mL无菌水的锥形瓶当中，然后在锥形瓶中取1mL的液体加入含有9mL无菌水的试管，得到10-1的土壤样品。再从10-1的茶叶样品中取1mL加入含有9mL无菌水的试管，得到10-2的土壤样品。同样的方法分别得到10-3、10-4、10-5的土壤样品。接下来的步骤与茶树叶片的处理方法一样［5］。

待内生菌培养出来以后，根据其形态大小的差异，进行分离纯化。具体方法是，将培养好的内生菌分类，把不同的菌体分别接入试管斜面（PDA培养基，28℃）进行培养纯化。若在试管斜面培养中出现不同的菌体，则再将两种不同的菌体接入两个不同的试管斜面中继续培养，直到得到纯化的菌种为止。

1.2.2 茶多酚粗提物的提取 采用超声波提取法：首先将样品茶叶用食物搅拌机粉碎成为细小颗粒，过100目的筛网，再将筛选后的颗粒，按1∶45的料液比配制成溶液。用超声波细胞破碎仪80Hz粉碎15min，在10000r/min，4℃的条件下离心10min，取上清液［6］。

1.2.3 酯型儿茶素的转化 将配制好的沙氏培养液20mL加入100mL的三角瓶中，加入1mL没食子酸和1mL焦性没食子酸，再加入茶多酚底物，将pH调至4.5，121℃ 30min消毒［7］。

在无菌操作的条件下，分别将已经纯化好的菌种接种至上述100mL的三角瓶当中。以不接菌种作为对照。把三角瓶全部放置在摇床中用28℃，160r/min培养5～7d。

1.2.4 儿茶素转化的薄层层析 转化结束后，离心（4500r/min，10min）分离菌丝体和发酵液。各菌液分别用30mL氯仿萃取菌丝体和发酵液，振荡0.5h，合并萃取液，减压蒸发除去溶剂，残留物用V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1的混合溶媒溶解，移至1.5mL离心管内，用于分析。

薄层色谱（TLC）法的精密度足以将本实验的转化产物迅速分析出来，且操作方便，因此，本实验采用薄层色谱法进行转化产物的分析，将已预制的硅胶板放至烘箱中用105℃活化1h，再放入干燥器内静置冷却到室温后，用上述得到的各种菌种的转化液进行点样，于层析缸中进行层析。层析剂：异丁醇∶醋酸∶水=40∶10∶50。层析过程在4℃冰箱中进行。层析结束后取出层析板，用电吹风吹干。最后，用碘显影法进行显色，将碘单质固体倒进空的层析缸当中，把吹干的层析板放进去，盖紧盖子。利用碘升华的碘蒸气显色，待显影出初步轮廓后取出，在0.1%三氯化铁溶液中浸泡30s，再用蒸馏水冲干净。照相并用记号笔标出点样点，计算出各斑点的比移值Rf值，根据斑点面值的大小，采用统一归一法计算转化率。

转化率公式如下［8］：

式中：P1为酯型儿茶素在转化液中薄板上的面积；P2为酯型儿茶素在标准品薄板上的面积。

1.2.5 生理生化实验［9］革兰氏染色实验；孢子染色；糖类酵解实验；尿酶实验；接触酶实验。

1.2.6 形态学鉴定活性真菌［10］利用显微镜观察活性菌种和其孢子的生理形态。

2 结果与讨论

2.1 从茶树根际土壤、树叶和茎中分离纯化出的内生菌

从茶树根际土壤、树叶和茎中根据其生长状态的不同（包括颜色、大小、形状）分离出十几种样品，并分别对其进行试管斜面的纯化培养。

2.2 薄层层析结果分析

图1所示，土壤筛选出的菌种将简单儿茶素转化为酯型儿茶素，其中酯型儿茶素的Rf值为0.259，转化率为22.22%。茶多酚标准品中酯型儿茶素的Rf值为0.246，简单儿茶素的Rf值为0.75［11］，这证明了菌体转化液中，简单儿茶素的浓度大大减少了，而酯型儿茶素的浓度有一定程度的增加。说明了菌种利用简单儿茶素转化成为酯型儿茶素，即是我们所需要的具有强转化能力的活性菌种。

图1 活性菌种转化效果

在图2中，土壤筛选出的另一种内生菌种也能将简单儿茶素转化为酯型儿茶素，其中酯型儿茶素的Rf值为0.225，转化率为12.5%。这意味着转化液中简单儿茶素的浓度变少了，而酯型儿茶素的含量有所增加，所以证明其具有一定的转化能力，但其转化能力不强。这是弱转化菌种。

如图3所示，对照中不能将简单儿茶素转化为酯型儿茶素，其中酯型儿茶素的Rf值为0.25，转化率为0.51%。无论简单儿茶素条带的面积还是酯型儿茶素条带的面积与标准品都没有明显区别，证明其简单儿茶素的浓度和酯型儿茶素的浓度并没有太大的变化，故判断其不具有转化能力。

图2 弱转化能力菌转化效果

图3 对照分析

表1 活性菌种、弱转化能力菌种及对照对简单儿茶素的转化结果

综合分析三个菌种，发现活性菌种的转化能力比较强，转化率为22.22%，而没接菌种的培养液和转化能力较弱的菌种，其转化率分别只有0.51%和12.5%，远远低于活性菌种的转化率。

2.3 生理生化实验及形态学检测结果

生理生化的实验结果表明活性菌种基本符合真菌的特征（表2）。从PDA培养基的培养菌落形态可以观察到，活性菌落类似丝状真菌，菌种呈白色绒毛状，中央有絮状突起边缘不整齐。成熟的菌种还带有少许灰色。因此，由菌落形态推断出菌种有可能是丝状真菌。

表2 活性菌种生理生化测试结果

菌丝和孢子囊孢子在显微镜下的观察结果见图4。活性真菌的菌丝呈放射性生长，菌丝之间没有横膈膜。菌丝分裂出大量的孢子囊孢子，呈圆形或者卵形。孢壁较粗糙，较深色。孢壁单层，孢子与联孢壁丝之间具有间隔。而分离出来的孢子囊孢子又直接长出放射性的营养菌丝。产孢子囊孢子的内生菌根菌通常处在于根际土壤之中。

根据活性菌种的在PDA培养基的菌落特征和显微镜下的观察，可得活性菌种是丝状真菌。查真菌鉴定手册，可以推断出藻状菌纲、毛霉目、内囊霉科、内囊霉属。关于这种具有强转化简单儿茶素活性的真菌的其他性质，包括转化动力学、发酵最佳参数以及毒性方面的研究，有待深入进行。

图4 活性菌种的菌丝

3 结论

3.1 从茶树的根际土壤、茶树的茎叶中分离并纯化出十多种颜色、大小和形状不相同的内生菌。

3.2 从茶树的根际土壤和茶树的茎叶中分离纯化的内生菌中筛选出具有转化简单儿茶素为酯型儿茶素的活性菌种，并具有最大转化率（22.22%）。

3.3 根据筛选出的活性菌种的生理生化特性，PDA培养的生长形态和生长状况还有显微镜下活性菌种的菌丝和镜检下活性菌体产生的孢子囊孢子的形态判断其基本的类型为藻状菌纲、毛霉目、内囊霉科、内囊霉属。

［1］顾谦.茶叶生物化学［M］.北京：中国科学技术出报社，2002：48-63.

［2］Sun XH，Man F，Pang LY.Fungal biotransformation of mosapride by Cunninghamella elegans［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009（1）：82-89.

［3］Zhang HF，He GQ，Liu J.Production of gastrodin through biotransformation of p-2-hydroxybenzyl［J］.Enzyme and Microbial Technology，2008（1）：43：25-30.

［4］吴秀丽，王艳，赵文倩.一种真菌对人参皂苷Rg3的转化［J］.微生物学报，2008，48（9）：1181-1185.

［5］陈玮君.酸性PDA培养基的制作［J］.河南农业，1996（1）：29.

［6］郭树琴，吴胜举，牛春玲，等.超声提取绿茶茶多酚研究［J］.陕西师范大学学报：自然科学版，2009，37（1）：36-38.

［7］李凡.医学微生物学［M］.北京：高等教育出版社，2008：43-98.

［8］王丽娟，王敏，温竹.三种真菌对洋地黄毒苷的生物转化特性研究［J］.天津科技大学学报，2009，23（3）：8-12.

［9］沈萍.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，1999：12-189.

［10］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学出版，1979：12-324.

［11］黄洋，姜建国，严媛.薄层层析后生物显影检测茶多酚组分的抑菌效果［J］.广州食品工业科技，2003（1）：19.

Microbial transformation of tea epicatechins into epigallocatechin gallate by the active fungi

DENG Zhi-hui1，CUI Tang-bing2
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

The research on the transformation of simply tea catechins（epicatechin）into ester type catechins（epigallocatechin gallate）with the selected active fungi from tea fresh leaves，tea stem and the earth around the tea were carried out.The results showed the selected active fungi had the activity of transformation for epicatechins into epigallocatechin gallate.The active fungi was proven as a fungus specie of Phycomycetes Mucorales Endogonaceae and Endogone based on the morphologic physiololgy and biochemical tests.

epicatechin；epigallocatechin gallate；active fungi；microbial transformation

TS201.2

A

1002-0306（2011）02-0169-03

2010-03-12

邓志汇（1986-），男，硕士研究生，研究方向：食品科学。

国家863项目（2007AA100404）。