郑惠娜，章超桦，秦小明，吉宏武，刘书成，曹文红

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524025）

活性炭静态吸附马氏珠母贝胰酶水解产物中氨基酸特性研究

郑惠娜，章超桦*，秦小明，吉宏武，刘书成，曹文红

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524025）

采用胰酶酶解马氏珠母贝肉蛋白，研究了活性炭静态吸附前后酶解产物中氨基酸及各组分的变化情况。结果表明：在马氏珠母贝胰酶水解体系中，结合态和游离态芳香族氨基酸分别被吸附67.4%和42.3%，处于结合态的芳香族氨基酸更易于被活性炭吸附，并且活性炭吸附后，分子量较大组分的蛋白或多肽含量明显下降。

马氏珠母贝，胰酶，高F值寡肽，活性炭

酶法制备生物活性肽是目前研究的热点，其中高F值寡肽是一类含有高支链氨基酸BCAA（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）和低芳香族氨基酸AAA（酪氨酸和苯丙氨酸）的特殊生物活性寡肽混合物，其不仅具有辅助治疗肝性脑病、改善肝昏迷程度和精神状态的作用，对于酒精、药物等所引起的急慢性肝损伤也起到了积极的保肝护肝作用［1］。在高F值寡肽制备过程中，有效脱除芳香族氨基酸保留支链氨基酸既是关键技术步骤也是难点。理论上，高效液相层析法、离子交换法、吸附色谱法等均具有可行性，但从工业应用角度考虑，吸附法更具有实际可操作性［2］。基于此，本研究选用珍珠养殖业的副产品马氏珠母贝肉为原料制备水解物，探讨活性炭对其胰酶水解产物中氨基酸的吸附特性，为马氏珠母贝高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

马氏珠母贝 购于湛江市东风市场，原料处理：将原料去壳取肉后清水冲洗干净，然后用保鲜袋分装，置-20℃冷冻备用；胰酶 北京奥博星生物科技有限公司；AK-310型、AK-220型活性炭 广州鸿生碳业化工有限公司；医药级针剂、食品级活性炭 北京太平洋活性炭制品有限公司；767针剂活性炭 上海正海活性炭有限公司；磷酸异构酶triosephosphate -isomerase（26625Da）、肌 球 蛋 白 myoglobin（16950Da）、抑肽酶 aprotinin（6512Da）、胰岛素 B insulin-B（3496Da）、杆菌肽bacitracin（1423Da） 分子量标准品，美国Bio-Rad公司；三肽Gly-His-Leu（423Da） 北京华美生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

数显pH-25C酸度计 上海康仪仪器有限公司；Sigma 3K3高速冷冻离心机 贝朗国际生物工程公司；T18 basic高速组织捣碎机 德国IKA集团公司；AUW120电子天平 日本岛津仪器公司；恒温数显水浴锅 余姚东方电工仪器厂；THZ-82恒温摇床 常州国华电器有限公司；KDN-08C自动凯氏定氮仪、KDN数显消化炉 上海新嘉仪器有限公司；HITACHI 835-50氨基酸自动分析仪 日立集团有限公司；Waters 600E泵、Waters 2487紫外检测器 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 马氏珠母贝肉蛋白的制备 将马氏珠母贝肉采用匀浆机匀浆3min（每隔30s停一次），然后按1∶8的比例（w/v）加入蒸馏水，煮沸10min，蒸煮过程中慢慢搅拌以灭活内源酶及去除一些杂质；然后冷却至室温，于10℃下，离心力6000×g离心20min，去除漂浮于上部的脂肪及上清液，收集马氏珠母贝肉固体蛋白沉淀（HTPM），贮存于-20℃用于进一步研究。

1.2.2 AAA标准溶液的配制 基于马氏珠母贝肉蛋白氨基酸组成特点，称取1.51g酪氨酸与1.49g苯丙氨酸溶于去离子水中，定容到1L，得标准AAA溶液浓度为3.0g/L。

1.2.3 BCAA标准溶液的配制 称取0.84g缬氨酸，0.78g异亮氨酸与1.39g亮氨酸溶于去离子水中，定容到1L，得标准BCAA溶液浓度为3.0g/L。

1.2.4 α-氨态氮的测定 参考文献［3］方法。

1.2.5 最佳活性炭的筛选 称取0.4g干粉活性炭于40mL AAA或BCAA标准溶液中，在25～30℃条件下于恒温摇床振荡3h后，过滤得清液，采用α-氨态氮的测定方法测定溶液中AAA及BCAA的减少总量，计算每克活性炭吸附芳香族氨基酸或支链氨基酸的α-氨态氮的质量，结果计为：（α-AA氨态氮）g/g（活性炭）。

1.2.6 马氏珠母贝胰酶酶解产物的制备 称取马氏珠母贝肉蛋白HTPM 50g置于三角锥形瓶中，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液，然后于高速组织捣碎机中匀浆2min，在恒温水浴中预热至50℃后加入胰酶启动酶解反应，在锥形瓶口套上保鲜膜，减少酶解过程中水分损失，于恒温摇床中酶解5h后，95℃水浴灭酶10min，冷却至室温，10000r/min离心10min，收集上清液用于下一步研究。

1.2.7 活性炭静态吸附马氏珠母贝胰酶水解产物取一定量的酶解液，按照1∶50的比例加入活性炭，在室温（25～30℃），pH2.5条件下进行吸附，吸附3h，吸附完成后10000r/min高速离心15min，收集上清液测定氨基酸组成及分子量分布。

1.2.8 氨基酸组成分析 称取样品数毫克，加入2mL 5.7mol/L HCl，置于110℃烘箱内水解24h，然后除去过量的HCl，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀。采用氨基酸自动分析仪分析，上机条件：流动相为专用缓冲液PI-1、2、3、4（分别为pH2.2、3.3、4.0、6.4柠檬酸钠缓冲液），流速：0.225mL/min，温度：25℃，上样量50μL。

1.2.9 分子量分布分析 吸附前后水解产物的分子量分布采用WatersTM高效体积排阻色谱（HPSEC Waters Corporation，Milford MA，USA）进行测定，分析柱为蛋白凝胶柱PROTEIN-PAK 60（WAT085250）。此分析柱是以硅胶为基质，表面键合一些疏水性基团的凝胶柱。分子量测定范围在1000～20000Da。流动相为pH7.2 0.05mol/L Tris-HCl，流速0.7mL/min，检测波长214nm，温度25℃。采用分子量标准品：磷酸异构酶 triosephosphate-isomerase（26，625Da），肌球蛋白 myoglobin（16950Da），抑肽酶 aprotinin（6512Da），胰岛素 B insulin-B（3496Da），杆菌肽bacitracin（1423Da），三肽Gly-His-Leu（423Da）绘制分子量标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 最佳吸附型号的筛选

为了便于分析及测定，本研究采用芳香族氨基酸和支链氨基酸标准溶液对五种不同型号的活性炭进行筛选。两种标准溶液均以马氏珠母贝肉蛋白中芳香族氨基酸和支链氨基酸的组成特点进行配制。活性炭具有吸附带有苯环结构物质的特性［4］，因此，其对芳香族氨基酸具有一定的吸附作用，已有许多研究报道采用活性炭吸附酶解产物中的芳香族氨基酸［5-10］。表1分别列出了五种活性炭对芳香族氨基酸和支链氨基酸的吸附效果。

表1 活性炭对AAA及BCAA静态吸附能力的比较（n=3）

从表中结果可看出，活性炭对芳香族氨基酸的吸附作用明显大于对支链氨基酸的吸附作用。五种活性炭中，B、C、D 3种活性炭对芳香族氨基酸吸附效果较接近，但活性炭D对支链氨基酸的保留效果相对较好，芳香族氨基酸氨基氮被吸附量与支链氨基酸氨基氮被吸附量比值越高，说明活性炭对芳香族氨基酸的吸附效果或对支链氨基酸的保留效果越好，因此，活性炭D能够较好吸附脱除芳香族氨基酸保留支链氨基酸，选择食品级活性炭进行下一步吸附实验。

2.2 活性炭吸附前后氨基酸组成变化

马氏珠母贝胰酶水解产物活性炭吸附前后的氨基酸组成见表2。由表2可知，每100mL酶解液活性炭吸附前后氨基酸总量分别为1812.65、1320.34mg，损失量为492.31mg，损失了27.16%。并从活性炭对酶解液中的芳香族氨基酸和支链氨基酸的吸附效果来看，酪氨酸、苯丙氨酸含量分别减少49.32%和52.89%，同时，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸含量分别减少25.00%、32.60%和19.91%。

为了进一步分析活性炭对芳香族氨基酸和支链氨基酸的吸附效果，本研究分别分析了活性炭对处于结合状态和游离状态的芳香族氨基酸和支链氨基酸的吸附情况，结果见图1。

表2 活性炭吸附前后胰酶水解产物氨基酸组成（mg/100mL）

图1 活性炭对胰酶水解产物中不同状态氨基酸（AAA和BCAA）吸附量的比较

从图1可以看出，无论是处于结合状态还是游离状态，活性炭对芳香族氨基酸的吸附量均高于支链氨基酸。酶解产物中约51.2%的芳香族氨基酸和24.69%的支链氨基酸被活性炭吸附。并且，结合状态（蛋白质或多肽形式）的AAA（67.4%）比游离状态的AAA（42.3%）更易于被活性炭吸附。与此同时，31.1%结合状态的BCAA和13.2%游离状态的BCAA被活性炭吸附。之前有研究报道指出游离态BCAA易于被活性炭吸附［8］，这可能是由于不同的原料及酶水解系统所造成的差异性。在本研究的酶水解系统中，活性炭对处于结合状态的AAA的吸附效果要好于游离状态，所以，根据这一特性有望结合其他方法以达到制备马氏珠母贝高F值寡肽的目的。AAA结构相对特殊，含芳香环，且均为疏水性氨基酸，而活性炭表面具有特殊的乱层石墨结构微晶区，碳原子呈六角形排列，这种非极性结构使其对有机物碳氢部分有强烈的范德华力作用，并能使大多数含芳环化合物的芳环部分以平躺方式吸附［11］。因此，活性炭对氨基酸的吸附既受氨基酸自身性质影响也受氨基酸存在体系影响，即不同原料蛋白及酶解系统下，活性炭吸附性质既与氨基酸本身性质有关，也同该氨基酸与其他氨基酸存在的状态有关。

2.3 活性炭吸附前后组分变化

将分子量标准物质的保留时间（tr）和分子量的对数LogMw在平面坐标系中描点，得到分子量标准曲线，如图2所示。分子量回归方程为 LogMw= 6.4972-0.2261tr，决定系数为0.9837，说明两者线性相关性及回归性良好。

图2 分子量标准曲线

由分子量标准曲线计算得到活性炭吸附前后酶解液各组分的变化情况，结果见图3、图4。由图中结果可看出，酶解液经活性炭吸附后，分子量大于20000、10000～20000Da的组分明显减少，小于1000Da的组分略有降低，而分子量在5000～10000Da和1000～5000Da的组分则明显升高。可见活性炭对马氏珠母贝胰酶水解产物中分子量较大组分的吸附能力要强于对分子量较小组分的吸附能力，这与前面有关活性炭对结合态的AAA或BCAA的吸附性比对游离态强的分析相符。

图3 活性炭吸附前后HPSEC图谱

图4 活性炭吸附前后各分子量组成比较

3 结论

在马氏珠母贝胰酶水解体系中，活性炭对处于结合状态的AAA的吸附效果好于游离状态的AAA，并且活性炭吸附后，分子量较大组分的蛋白或多肽明显被吸附，能够得到含量较高的小分子肽组分。因此，可利用活性炭对马氏珠母贝胰酶水解产物的吸附特性并结合其他有效去除游离态芳香族氨基酸的方法，有望实现马氏珠母贝高F值寡肽的制备，达到马氏珠母贝高值化利用的目的。

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Characteristics of activated carbon for absorbing amino acids in static state from Pinctada martensii meat protein hydrolysates

ZHENG Hui-na，ZHANG Chao-hua*，QIN Xiao-ming，JI Hong-wu，LIU Shu-cheng，CAO Wen-hong
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China）

Pinctada martensii meat protein was hydrolysed using pancreatin，then the absorption capacity of activated carbon for amino acids in static state from Pinctada martensii meat protein hydrolysates were investigated.The results showed that in enzymatic hydrolysis system，the aromatic amino acids（67.4%）were adsorbed by activated carbon much easier in the form of proteins and peptides compared with the free state（42.3%）and the content of component with higher molecular weight，protein and polypeptides，decreased significantly.

Pinctada martensii；pancreatin；high fischer ratio oligopeptides；activated carbon

TS254.1

A

1002-0306（2011）02-0098-04

2009-12-25 *通讯联系人

郑惠娜（1979-），女，博士，讲师，主要从事水产品开发与利用研究。

国家科技支撑计划课题（2007BAD29B09）；农业部948项目（2006-G42）；广东海洋大学引进人才基金（0912259）。