陈学丽，叶立斌，励建荣，*，孙金才，陈 卫，许庆炎，Zhou K.

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310035；2.浙江海通食品集团，浙江慈溪315300；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061）

杨梅渣黄酮类化合物提取及其抗氧化活性研究

陈学丽1，叶立斌1，励建荣1，*，孙金才2，陈 卫1，许庆炎2，Zhou K.3

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310035；2.浙江海通食品集团，浙江慈溪315300；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061）

杨梅是我国的特产水果，年产量约为100万t，其中杨梅渣约占果实总重的10%。目前以杨梅为资源的食品工业已初具规模，然而在杨梅深加工过程中，杨梅渣都作为废物进行处理，对其开发利用仍然一片空白。基于此，以杨梅渣为研究对象，对杨梅渣中黄酮类化合物进行提取、浓缩、萃取，分成四个级分（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相）；用DPPH法、Fenton反应法和还原能力评价了四个不同级分的杨梅渣提取物的体外抗氧化能力。结果表明，杨梅渣粗提物正丁醇相和乙酸乙酯相具有较强的清除DPPH自由基能力，其半抑制浓度（IC50）分别为30、40μg/mL，分别是维生素C（IC50=110μg/mL）的3.67、2.75倍。

杨梅渣，总黄酮，提取，抗氧化

杨梅中含丰富的蛋白质、维生素、柠檬酸、多糖和多酚类等多种营养和功效成分［1］，具有消食、御寒、消暑、止泻、治疗痢疾以及生津止咳、清肠胃等多种药用价值，是水果中的医药珍品。现代研究表明，其中所含的黄酮类化合物［2-3］，如杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素等具有明显的抗溃疡、抗炎、抗菌、抗氧化、增强机体免疫力、软化血管、降血糖、降血脂等生理活性作用［4］。杨梅渣是杨梅榨汁或酿酒后的副产物，占杨梅总重的10%，年产量约为10万t，且呈逐年上升趋势，但均作为废物处理，污染环境。开发利用杨梅渣资源，不但解决了废渣处理所带来的环境污染问题，而且延长了杨梅产业链。因此，以杨梅渣为研究对象，提取其中的黄酮类化合物，开发其药用价值功能，对进一步利用杨梅资源具有重要的现实意义。鉴于此，本文对杨梅渣的黄酮类物质进行了提取并对其抗氧化活性进行了初步研究，为杨梅渣的进一步开发提供一定的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

杨梅渣 浙江海通食品集团股份有限公司提供；DPPH（2，2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl） Sigma公司（Germany）。

MODULYOD-230型真空冷冻干燥机 Thermo Co.，Ltd.；UV-2550紫外可见光分光光度计SHIMADZU Co.，Ltd.；RE-52A旋转蒸发器、循环水式多用真空泵 SHB-ⅢA 上海亚荣生化仪器厂；KQ-100型超声波 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杨梅渣黄酮类化合物的提取 称取一定量的杨梅渣粉末，与70%的乙醇按料液比1∶30混匀，60℃超声提取30min，提取两次，真空抽滤，除去滤渣，合并滤液。滤液再经过旋转蒸发仪（45℃）浓缩至浸膏状。

1.2.2 杨梅渣黄酮类化合物的萃取 用三倍的去离子水溶解浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取两次，经旋转蒸发仪（45～55℃）浓缩至呈浸膏状，冷冻干燥，即得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相，于超低温冰箱保存，待用。

1.2.3 粗提物中总黄酮含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 精密称取 10mg芦丁（120℃干燥至恒重），用30%的乙醇溶液溶解，置于100mL容量瓶中，加30%的乙醇溶液定容，得100μg/mL芦丁标准溶液，备用。

准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于10mL刻度试管中，各加30%的乙醇至5.0mL，加5%的亚硝酸钠0.4mL，摇匀，放置5min，再加10%的硝酸铝溶液0.4mL，摇匀，放置5min，加4%的氢氧化钠溶液4.0mL，摇匀，最后加30%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置10min。在波长510nm处测定其吸光度。以浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.2 粗提物中总黄酮含量的测定［5-6］称取0.1g粗提物，用30%的乙醇溶液溶解，置于100mL的容量瓶中，加30%的乙醇溶液定容得1mg/mL的样品溶液，备用。每次准确量取2.0mL置于10mL刻度试管中，按照上述方法测定510nm处的吸光度，根据标准曲线求出浓度，计算总黄酮含量。

1.2.4 抗氧化作用

1.2.4.1 清除DPPH自由基的能力测定［7-10］将杨梅渣黄酮粗提物稀释成不同浓度梯度：50、100、200、400、600μg/mL，各取2mL上述浓度的粗提液于比色管中，再加入2mL 0.1mmol/L的DPPH甲醇溶液，混合均匀，30℃避光静置30min后测定517nm处的光吸收值。同时以相同浓度梯度的VC作为对照，重复上述操作。

DPPH自由基清除能力的计算公式为：

式中，Ab为2mL乙醇或水+2mL DPPH溶液的吸光值，Ac为2mL样品溶液+2mL甲醇的吸光值，As为2mL样品+2mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.4.2 清除羟基自由基的能力测定［11］参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，利用H2O2与二价铁离子混合后产生·OH。Fenton反应为：H2O2+Fe2+=OH-+·OH+Fe3+，但·OH具有很强的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕捉·OH并产生有色产物。该产物在510nm处有较强吸收，若加入具有清除·OH功能的被测物便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物的生成量减少，采用固定反应时间法，在510nm处测定吸光度，并做空白对照，便能测定被测物对·OH的清除作用。

式中：A损伤为反应体系原来的吸光度，A未损伤为加入提取液但不加入H2O2的吸光度，A加样为反应体系加入提取液后的吸光度。

将杨梅渣黄酮粗提物稀释成不同浓度梯度：50、100、200、400、600μg/mL。取6mmol/L水杨酸1mL于10mL试管中，加入2mmol/L的FeSO41mL，摇匀，再加入6mmol/L H2O21mL，摇匀，于37℃水浴中恒温15min后，测定其吸光度A损伤（用水作为参比）。测定后，各加入上述浓度的粗提液 1mL，摇匀，放置10min，再测定其吸光度 A加样，并用水代替 H2O2的A未损伤做参照，使用公式进行计算即可得清除率。同时以相同浓度的BHT和VC作为对照，重复上述操作。

1.2.4.3 还原能力的测定［12-16］将杨梅渣黄酮粗提物配成400μg/mL，取2.5mL样品于试管中，依次加入2.5mL 0.2mol/L PBS和2.5mL 1%六氰合铁酸钾溶液，于50℃水浴保温20min后快速冷却，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液。然后取2.5mL于10mL比色管中，依次加入2.5mL蒸馏水，0.5mL 0.1%三氯化铁，充分混合后，静置10min，在700nm处［17］测定其吸光值A（以蒸馏水作参比）。吸光度值越大，表示还原力越强（以BHT和VC作对照，重复上述实验）。

2 结果与分析

2.1 总黄酮的测定

2.1.1 标准曲线的绘制 从图1可以看出，芦丁浓度在0～50μg/mL范围内，与吸光度呈现良好的线性关系，相关性达到0.9996，线性回归方程为：y=0.0133x +0.0023，式中：y表示波长在510nm处的吸光度，x表示芦丁的浓度。

2.1.2 粗提物中总黄酮含量的测定 根据测定结果得出各样品中总黄酮含量，结果见表1。

表1 样品总黄酮含量

2.2 抗氧化能力的测定

2.2.1 清除DPPH自由基的能力 DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，对其清除的效果表明，样品能有效降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基和打断脂质过氧化链反应。杨梅渣黄酮类化合物的粗提物对DPPH自由基的清除效果见图2。

图1 芦丁标准曲线

图2 粗提物对DPPH自由基的清除作用

实验结果表明，随着粗提物浓度的增加，清除DPPH自由基的效果越好。乙酸乙酯相和正丁醇相对DPPH自由基的清除能力大于VC，而水相和石油醚相的清除能力相对较弱。根据线性回归方程，可以求出正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50（即清除率达到50%时所需药物的浓度）分别为30、40μg/mL，清除能力分别是VC的3.67倍和2.75倍（VC的 IC50为110μg/ mL），表明杨梅粗提物的乙酸乙酯相和正丁醇相表现出很强的清除DPPH自由基的能力。

2.2.2 清除羟基自由基的能力 由图3可知，杨梅渣粗提物对·OH有着一定的清除作用，且随着提取液浓度的增加，清除效果越好。实验结果表明，石油醚相在清除·OH方面表现出比另外三相更好的清除效果，清除效果小于VC，但大于BHT。

图3 粗提物对羟基自由基的清除作用

2.2.3 还原力的测定 还原力的测定，是检验样品是否为良好的电子供应者。实验结果表明，在浓度为400μg/mL时，乙酸乙酯相的还原能力略小于VC，但大于BHT。实验表明，乙酸乙酯相可能是良好的电子供应者，其供应的电子可使Fe3+还原为Fe2+，也可参与自由基反应，使其成为稳定的物质。

3 结论

3.1 芦丁浓度在0～50μg/mL范围内，与吸光度呈现良好的线性关系，杨梅渣粗提物乙酸乙酯相和正丁醇相中总黄酮含量较高，分别为13.0%，6.5%。

3.2 抗氧化实验结果表明，杨梅渣粗提物对DPPH自由基、羟基自由基的清除效果和还原能力都在一定浓度范围内呈现浓度依赖性，随着样品浓度的增加而增大。杨梅渣粗提物正丁醇相和乙酸乙酯相具有较强的DPPH自由基清除能力，其清除率IC50相应为30、40μg/mL，分别约为VC的3.67倍、2.75倍。

3.3 杨梅渣粗提物对DPPH自由基表现出很强的清除效果，乙酸乙酯相＞正丁醇相＞水相＞石油醚相，这与四个提取相总黄酮含量是呈正相关的。结合清除DPPH自由基能力和还原力来看，杨梅渣提取物正丁醇相和乙酸乙酯相有待进一步分离纯化及鉴定，以确定杨梅渣中抗氧化活性成分。

3.4 杨梅渣粗提物表现出良好的抗氧化性，具有广阔的开发前景，有望通过进一步研究开发纯天然的食品抗氧化剂，这对杨梅产业的发展大有裨益。

图4 粗提物还原力测定

［1］龚洁强，王允镔，林湄，等.杨梅果实品质与营养成分分析［J］.浙江柑橘，2004，21：31-32.

［2］Fang Z X，Zhang M，WANG L X.HPLC-DAD-ESIMS analysis of phenolic compouds in bayberries（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）［J］.Food Chemistry，2006，100（2）：845-852.

［3］Bao J S，Cai Y Z，Sun M.Anthocyanins，flavonols and free radical scavenging activity of Chinese bayberry（Myrica rubra）extracts and their color properties and stability［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（6）：2327-2332.

［4］李槟榔.天然食用抗氧化物的研究进展［J］.食品与发酵工业，1990（4）：17-23.

［5］Toor R K，Savage G P.Antioxidant activity in different fractions of tomatoes［J］.Food Research International，2005，38：487-494.

［6］Jia Z S，Tang M C，Wu J M.The determination of flavonoids contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals［J］.Food Chemistry，1999，64（4）：555-559.

［7］Amarowicz R，Naczk M，Shahidi F.Antioxidant activity of various fractions of non-tannin phenolics of canola hulls［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48：2755 -2759.

［8］吴琼英，贾俊强.柚皮黄酮的超声辅助提取及其抗氧化性研究［J］.食品科学，2009，30（2）：29-33.

［9］BenjakulS，VisessanguanW，PhongkanpaiV，etal. Antioxidative activity ofcaramelisation products and their preventive effect on lipid oxidation in fish mince［J］.Food Chemistry，2005，90：231-239.

［10］Yen G C，Chen H Y.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43（1）：27-32.

［11］林燕如，丁利君.番石榴叶中黄酮类物质提取及其抗氧化性研究［J］.现代食品科技，2007，23（10）：58-61.

［12］Oyaizu M.Studies on product of browning reaction prepared from glucose amine［J］.Japanese Journal of Nutrition，1986，44：307-315.

［13］Shon M，Choi S，Kahng G，et al.Antimutagenic antioxidant and free radical scavenging activity of ethyl acetate extracts from white，yellow and red onions［J］.Food and Chemical Toxicology，2004，42：659-666.

［14］Chang L，Yen W，HUANG Shiowchyn，et al.Antioxidant activity of sesame coat［J］.Food Chemistry，2002，78：347-354.

［15］豆海港，陈文学，仇厚援，等.花椒提取物抗氧化作用研究［J］.食品研究与开发，2006，27（7）：14-16.

［16］Gu F L，Kim J，Khizar H，et al.Characteristics and antioxidant activity of ultrafiltrated Maillard reaction products from a casein-glucose model system［J］.Food Chemistry，2009，117：48-54.

［17］Yoshimura Y，Lijima T，Watanabe T，et al.Antioxidative effect of Maillard reaction products using glucose-glycine model system［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45：4106-4109.

Research on the extraction and anti-oxidation of flavonoids in Myrica rubra marc

CHEN Xue-li1，YE Li-bin1，LI Jian-rong1，*，SUN Jin-cai2，CHEN Wei1，XU Qing-yan2，Zhou K.3
（1.College of Food Science and Biotechnology Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China；2.Zhejiang Haitong Food Group，Cixi 315300，China；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061，USA）

Myrica rubra is a specific fruit species in China，annual production of which is about 1 million tons，and Myrica rubra marc accounts for 10%of total weight of the fruit.At present，the food industry based on Myrica rubra resources has a certain scale，while the utilization of Myrica rubra marc is still blank.The fractions were acquired from Myrica rubra marc by a series of steps including extraction and concentration，followed by extraction with petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol.The anti-oxidative activities of the extracts were evaluated in vitro，including DPPH radical scavenging activity，Fenton action and reducing power methods.The results showed that n-butanol fraction and ethyl acetate fraction of Myrica rubra marc crude extracts exhibited strong scavenging abilities for DPPH free radical，their half-inhibitory concentration（lC50）were 30μg/mL and 40μg/mL，respectively，and were approximately 3.67 times and 2.75 times as much as that of Vitamin C（110μg/mL）.

Myrica rubra marc；total flavonoids；extraction；anti-oxidation

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0085-04

2010-01-08 *通讯联系人

陈学丽（1985-），女，硕士，研究方向：农产品加工与贮藏。

“十一五”国家科技支撑计划重点项目（2006BAD27B03）；宁波市农业攻关国际科技合作项目（2008C10042）。