崔韶晖，马 堃，赵轶男，张树彪

（大连民族学院生命科学学院/国家民委-教育部重点实验室辽宁省高校重点实验室，辽宁大连116605）

小麦粉中神经酰胺类物质的提取及结构分析

崔韶晖，马 堃，赵轶男，张树彪

（大连民族学院生命科学学院/国家民委-教育部重点实验室辽宁省高校重点实验室，辽宁大连116605）

从小麦粉中提取纯化了一种神经酰胺类物质，并对其结构进行了分析。实验以小麦粉为材料，首先用索氏提取法以95%乙醇为溶剂进行粗提，粗提物经石油醚萃取、旋转蒸发仪浓缩后，过三次硅胶柱层析提取，再经二次重结晶纯化，得到白色无定型粉末状神经酰胺类物质。使用高效液相色谱/蒸发光散射检测器（HPLC/ELSD）对其进行纯度检测，用红外光谱（IR）和质谱（MS）对其结构进行鉴定。实验结果分析表明该物质为分子量397.3，分子式C24H47NO3的神经酰胺类化合物。

小麦粉，神经酰胺，HPLC/ELSD，IR，MS

神经酰胺（Ceramide，Cer）类物质是皮肤角质层的重要组成成分，同时作为细胞内的第二信使，通过活化多种蛋白激酶和转录因子参与细胞内信号传导，从而调控细胞生长、增殖、分化、凋亡及损伤等多种生理、病理过程［1］。近年来，随着对神经酰胺类物质生物活性的研究与应用开发，这类物质已经成为功能性保健品、食品和化妆品等的重要有效活性成分，具有非常重要的应用价值。但是，由于神经酰胺在生物试样中的含量极低，而且分子结构存在多样性，导致天然神经酰胺的提取和分析比较困难［2］。天然植物中含有的神经酰胺具有良好的生物活性和安全性，因此，从各种植物中分离提取此类化合物的研究受到广泛关注［3-4］。本研究首次从来源广泛、成本较低的小麦粉中提取到一种神经酰胺类物质，并对其结构进行了分析，为今后开发利用植物中的神经酰胺提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦粉；C2-Cer 购于 Sigma公司，纯度为98%；乙腈、四氢呋喃、异丙醇、甲醇、正丙醇 色谱纯试剂，购于天津科密欧公司；层析硅胶 100～200目，购于上海五四化学试剂公司；95%乙醇、石油醚、丙酮、三乙胺、甲酸、甲醇等 均为国产分析纯试剂。

索氏提取器，Z型层析柱，BüCHI R-220型旋转蒸发仪，LC-10AD高效液相色谱仪/蒸发光散射检测器，HP 1100MSD型质谱仪，FREEZONE4.5型真空冷冻干燥机，FTIR-8101红外光谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 神经酰胺的粗提 称取20g小麦粉装入索氏提取器中，在250mL圆底烧瓶中加入95%乙醇150mL，水浴恒温 80～90℃，用索氏提取法提取8～10h。同法提取20次，合并提取液后过滤，用去离子水将滤液中乙醇浓度调至70%后，用石油醚萃取，萃取液用旋转蒸发仪浓缩后用于柱层析。

1.2.2 柱层析分离 浓缩液经硅胶柱层析三次分离纯化，洗脱液为（石油醚∶丙酮=7∶3）200mL，洗脱流速为1d/s，收集后用旋转蒸发仪浓缩。

1.2.3 真空冷冻干燥 将上步得到的浓缩液进行真空冷冻干燥，析出白色的粉末状固体。

1.2.4 重结晶纯化 将得到的粉末状固体溶于丙酮中，加热溶解后用真空泵进行快速抽滤，将滤液浓缩后，低温4℃放置，待有固体物析出，进行抽真空干燥，重复多次重结晶纯化。

1.2.5 高效液相色谱/蒸发光散射检测器（HPLC/ ELSD）分析［5］HPLC分析所用色谱柱为 Kromasil C18柱，流动相A为乙腈∶四氢呋喃=95∶5（10mmol/L三乙胺+10mmol/L甲酸）；B为乙腈∶四氢呋喃∶异丙醇=40∶5∶55（10mmol/L三乙胺+10mmol/L甲酸），流速为0.6mL/min，进行梯度洗脱，洗脱时间设定为15min：T=0min（A=100%）；T=15min（B=100%），蒸发光散射检测器温度设为30℃。

1.2.6 红外光谱（IR）分析 采用FTIR-8101红外光谱仪，KBr压片法。

1.2.7 质谱（MS）分析［6］采用HP 1100MSD型质谱仪，质谱条件为正离子模式，雾化气流为3L/min，气帘气压为11PSI，离子源电压为5000V。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱（HPLC/ELSD）检测神经酰胺提取物的纯度

将从小麦粉中提取纯化的白色无定型粉末溶于色谱纯的正丙醇中用于HPLC/ELSD分析测定，使用梯度洗脱法，经过多次测定只得到一个主峰，样品峰保留时间为3.233min，杂质含量很少，表明提取的化合物纯度较高，结果如图1所示。

图1 小麦粉中神经酰胺类提取物的高效液相色谱（HPLC/ELSD）图

2.2 提取物的红外光谱（IR）分析

将纯化的提取物进行红外光谱（IR）分析，谱图如图 2所示，IR谱显示有酰胺的特征吸收峰（3449.1、1740.0、1454.5、1275.1cm-1）和 羟 基（2926.4cm-1）、长链脂肪烷基（723.4cm-1）的特征吸收峰，分析表明在3449.1cm-1处产生一弱峰，即存在仲酰胺的 VN-H伸缩振动，说明含有-NH-基团；1740.0cm-1产生一强峰，即存在酰胺基团中的C=O伸缩振动，说明含有酰胺基团；1275.1cm-1处峰是仲酰胺VC-H基团的特征峰；1454.5cm-1处峰是仲酰胺δN-H基团的特征峰。同法分析了购于Sigma公司的C2-Cer（98%），对照比较了官能团的特征吸收峰见图3所示，结果表明，该提取物为含有羟基的仲酰胺化合物，区别是含有的碳链长度不同。

图2 小麦粉中神经酰胺类提取物的红外光谱（IR）谱图

图3 C2-Cer的红外（IR）光谱图

2.3 质谱（MS）分析提取物的分子结构和分子量

将纯化的提取物进行质谱分析，质谱图如图4所示，在m/z=398.3处得到一个较强的响应峰，因为分析模式为［M+1］+模式，表明该化合物分子量为397.3，结合红外光谱和质谱数据分析并计算得出该神经酰胺类化合物的分子式为：C24H47NO3。

图4 小麦粉中神经酰胺类提取物的质谱谱图

3 讨论

神经酰胺类物质虽然广泛存在于动、植物中，但由于天然神经酰胺分子结构具有多样性，以及它在生物试样中的含量极低，没有紫外和荧光发色团，也很难被衍生化，导致神经酰胺的分离和分析比较困难［7］。本研究从小麦粉中提取的一种神经酰胺类化合物，采用HPLC/ELSD系统直接对其进行了分析，不需要任何的衍生化过程，方便可靠。作为对照使用紫外检测器的HPLC没有吸收。进一步使用红外光谱和质谱对提取物进行了结构上的分析，红外光谱数据分析表明含有仲酰胺基团、-OH基团、C骨架等，该分析结果与从Sigma公司购买的C2-神经酰胺进行了对照分析，可确定为神经酰胺类化合物，其分子量为397.3，分子式为：C24H47NO3。今后将在此基础上对其分子结构进行进一步明确分析。本实验室先前研究了魔芋粉中神经酰胺类物质的分离提取和分析［8］。尽管对天然植物中神经酰胺的分析研究已经持续了几十年，然而目前仍没有一种令人满意的高效提取分析方法，根据神经酰胺样品的来源、含量、种类和不同的使用目的，发展高效分离和分析技术将是推动神经酰胺应用及其产业发展的重要基础和技术关键。

［1］Hannun Y A.Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress［J］.Science，1996，274：1885-1859.

［2］孙庆杰.天然神经酰胺的研究与开发［J］.中国油脂，2003，28（2）：11-15.

［3］陈玉，杨光忠，李援朝.雷公藤中神经酰胺类化合物的分离与结构鉴定［J］.华中师范大学学报：自然科学版，2005，39（2）：225-227.

［4］徐石海，曾陇梅，苏镜娱.两种神经酰胺分离与结构鉴定［J］.中山大学学报：自然科学版，1997，36（2）：84-87.

［5］CremestiA E，FischlA S.Currentmethodsforthe identification and quantitation of ceramides［J］.Lipids，2000，35（9）：937-945.

［6］Raith K，Neubert R.Liquid chromatography elect rospray mass spectrometry and tandem mass spectrometry of ceramides［J］.Analytica Chimica Acta，2000，403：295-303.

［7］谢建平，张敏莲，刘铮.神经酰胺及其分析与分离技术研究进展［J］.精细化工，2002，9（7）：31-35.

［8］崔韶晖，姜波，关翔宇，等.魔芋中神经酰胺类物质的分离提取和分析［J］.生物技术，2007（5）：45-47.

Extraction and structure analysis of a species of ceramide from wheat powder

CUI Shao-hui，MA Kun，ZHAO Yi-nan，ZHANG Shu-biao
（Key Laboratory of Ministry of Education-The State Ethnic Affairs Commission，Key Laboratory of University of Liaoning Province/Life Science College，Dalian Nationalities University，Dalian 116605，China）

A species of ceramide homolog from wheat powder was extracted and purified and its structure analysis was carried out.Wheat powder was treated with 95%of ethanol by means of sorbitic extraction at first.Then the crude product was extracted from petroleum ether，concentrated by rotatory evaporator，extracted three times by silica gel column chromatography，recrystallized twice，respectively，and white undefined ceramide powder was obtained.By means of HPLC/ELSD，the purity of the product was detected.lts structure was characterized via lR and MS spectroscopy.Experimental results showed that the molecular weight of the ceramide was 397.3，molecular formula was C24H47NO3.

wheat powder；ceramide；HPLC/ELSD；lR；MS

TS210.1

A

1002-0306（2011）02-0079-03

2009-07-08

崔韶晖（1966-），女，博士，副教授，主要从事化学生物技术领域的研究。

辽宁省博士启动基金项目（20031082）；大连民族学院人才引进基金（20036209）。