韩冬梅，廖小军，李淑燕，胡小松，吴继红

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，农业部果蔬加工重点开放实验室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083）

酶法制取橙皮果胶的研究

韩冬梅，廖小军，李淑燕，胡小松，吴继红*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，农业部果蔬加工重点开放实验室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083）

纤维素酶酶系组成复杂，不同来源纤维素酶在果胶提取中表现出的作用不同。采取与前人研究不同的纤维素酶对橙皮果胶进行提取，对三种不同来源的纤维素酶比较分析，筛选出一种价格低廉、适合果胶提取的纤维素酶，并采用四元二次通用旋转组合设计方法研究了其提取果胶工艺中缓冲溶液的pH、提取时间、酶添加量、提取温度对果胶得率的影响；建立数学模型，寻求测定条件的最优组合；以Design Expert软件进行分析，模型经检验差异显著，失拟检验不显著，具有良好的统计学意义，最优组合为：酶添加量3.38mL、时间6.66h、温度47.5℃、pH4.95，预测模型果胶得率为14.43%，验证实验得率为14.79%，大大提高了纤维素酶制取果胶的得率，远远高于文献报道，并且酶的价格低廉，大大降低了生产成本。

橙皮，果胶，纤维素酶，二次通用旋转组合设计

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赣南脐橙 新鲜采摘，果皮部分未经打蜡，90℃水浴灭酶5min，40℃真空干燥至含水量11.49%。粉碎过60目筛，真空包装后冷藏备用；纤维素酶Sigma公司、日本Fluka公司、上海凯样生物科技有限公司。

飞鸽牌TDL-5型低速离心机 广州正一科技有限公司；数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；ZF-400真空包装机 北京瑞明包装机械科技有限公司；紫外分光光度计 北京普析通用有限责任公司；水浴摇床 太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酶液的配制 精确称取纤维素酶0.3000g，用配好的的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容到100mL容量瓶中，醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH根据提取的实验设计变化，根据实验要求当天配制。

1.2.2 酶活的测定 纤维素酶活根据 Ghose［9］和Miller［10］的方法测定。滤纸酶活单位定义为：1min生成1!moL葡萄糖所需要的酶量。果胶酶活力的测定根据Beg的方法测定［11-12］。果胶酶活定义：1g酶粉或1mL酶液在50℃、pH3.5的条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。

1.2.3 工艺流程 赣南橙橙皮粉（60目）→水浴摇床酶提取→离心→上清液→85℃灭酶→2倍体积乙醇沉淀过夜→离心→沉淀→乙醇清洗→真空干燥

1.2.4 操作要点 称取6.000g橙皮粉，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，料液比1∶15；加入一定的酶液，放入水浴摇床中提取，提取液5000r/min，离心10min，用50mL蒸馏水清洗残渣，离心，合并上清液。上清液85℃水浴灭酶5min，冷却，2倍体积乙醇沉淀过夜，5000r/min，离心5min，分离沉淀出的果胶，用400目滤布15mL乙醇清洗两次，每次5min以除去色素和游离的中性糖，最后40℃真空干燥3h，称量（精确到0.0000），终产品含水量为11.6%。

2 结果与分析

2.1 酶的筛选

果胶的提取条件为：45℃，6h，pH4.8，酶添加量2mL，料液比1∶15。

纤维素酶系中包括内切酶（EG1、EG2），外切酶（CBH1、CBH2），"-葡聚糖酶。不同来源的纤维素酶系其内部各酶比例不同，因而可能导致整体表观作用不同，同时"-葡聚糖酶对果胶也具有一定的破坏作用，导致了纤维素酶在橙皮果胶提取中表现出双重作用。由于纯酶的成本高，在果胶提取中难以实现产业化，因此只能寻找合适组成比例的酶作为果胶提取用酶。

由图1可见，Sigma公司C0615纤维素酶滤纸酶活最高，果胶酶活未检出，但当作用于果胶提取时，原料中果胶被分解。Zykwinska A在研究中测定了诺维信产纤维素酶中鼠李糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶等多种能够分解果胶侧链的酶，发现这些酶存在一定的活性，因此可能是这些酶的存在以及纤维素酶系中的"-葡聚糖酶的存在导致实验中果胶分解。实验中高剂量和低剂量酶添加量在不同提取时间的组合实验中，作用于原料后都只能得到澄清的均一溶液，因此断定此酶不适合果胶的提取，仅适合于果汁澄清。日本Fluka公司产纤维素酶R-10也存在同样问题。上海凯洋公司产纤维素酶的果胶酶活未检出，滤纸酶活力虽然最低，但将其作用于果胶提取，得率最高，因而可以将此酶用于果胶的酶法提取研究。

图1 不同产品纤维素酶酶活及对果胶提取的影响

2.2 酶添加量对橙皮果胶提取的影响

固体酶活力单位是121U/g，以缓冲溶液将固体酶配制成浓度为0.0030g/mL的酶液。

由图2可知，当酶使用量在低于0.5mL/g皮渣时，果胶提取率随加酶量的增加而增高，且增加幅度比较大，当使用量大于0.5mL/g皮渣时，随着酶使用量的增加，果胶得率又减小。经分析，由于实验所用纤维素酶并非纯酶，复合酶系中可能存在"-葡聚糖酶及其它能够水解果胶的阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶、半乳糖苷酶，果胶分子链水解，生成的低分子量果胶增加，在含有过滤清洗的工艺下这部分果胶损失。

图2 酶添加量对果胶得率的影响

2.3 提取时间对橙皮果胶提取的影响

由于提取用纤维素酶对果胶有一定的水解作用，且由于提取温度比较温和，随着提取时间的延长，提取液容易染菌，Shkodina［6］、邸铮［13］等在提取液中加入0.01%叠氮化钠作抑菌剂，叠氮化钠本身为呼吸抑制剂，剧毒，在实际生产中是不能使用的。因此控制提取时间在6～8h内以获取最大提取量，避免果胶被大范围水解。

图3 提取时间对果胶得率的影响

2.4 提取温度对橙皮果胶提取的影响

温度对果胶的提取影响比较大，有两个原因：一是高温能增加果胶溶出的传质动力，二是酶具有最适作用温度。当温度低于45℃时，随温度提高果胶得率增加速度很快，当温度高于45℃后，果胶得率又出现下降的趋势，传统的提取方法中以高温高酸提取果胶，因此在一定范围内提高温度对果胶得率影响是促进作用，所以当温度升高时，虽然同样是远离酶的最适温度，峰值左侧和右侧的变化速度不同。

图4 提取温度对橙皮果胶提取的影响

2.5 缓冲溶液pH对橙皮果胶提取的影响

图5显示pH在4.8附近，果胶提取率最高，在此处酶的活性最大，当pH增大或减小时，酶远离了最适pH，活性下降，但是当pH为4时，尽管其并非酶作用的最适pH，但结果显示果胶的提取率并没有随pH下降而降低，这是因为此时酸的作用占优势，因此是协同作用的结果。

图5 提取pH对橙皮果胶提取的影响

2.6 响应面优化

以酶添加量、提取时间、提取温度、提取pH四个因素，采用二次通用旋转实验进行设计，第一：满足其旋转性，即实验因素空间中与实验中心距离相等的球面上各处理组合的预测值的方差具有几乎相等的特性；第二：除了能满足其旋转性，能满足其通用性，即各个实验点与中心的距离ρ在空间编码值区间0＜ρ＜1的范围内，其预测值的方差基本相等的性质。实验设计中包括中心点7个，轴点8个，析因点16个，总处理数N=31［14］。因素水平分布及实验结果见表1及表2。

表1 四元二次通用旋转组合实验设计因素水平分布

以Design Experts软件的CCD模块对实验结果进行分析，方差分析结果如表3。

表2 二次通用旋转实验设计矩阵及实验结果

表3 方差分析表

方差分析表明方程的模型回归检验F=24.50，差异在0.01水平上极显著。失拟检验F=2.30，差异不显著，模型具有统计学意义。编码因素A、B、C、D、AB、BD、A2、B2、C2、D2差异显著，其他项差异不显著，剔除不显著项，回归模型的编码方程为：

（R2=0.9607，调整后 R2=0.9213，预测 R2= 0.7238）

优化后的工艺参数为：酶添加量0.56mL/g干皮渣（取活性为121U/g的固体酶0.3000g用缓冲溶液定容到100mL，）、提取时间6.66h、提取温度47.51℃、提取 pH4.95，此工艺基础上，预测果胶得率为14.43%，验证实验（实际提取温度为47.5℃）果胶得率为14.79%。

3 结论

本实验首先测定了三种不同来源的纤维素酶的滤纸酶活，果胶酶活，以及在不同的使用量下果胶的得率，据此选取上海凯洋公司的纤维素酶作为实验用酶。

通过单因素水平实验，确定了酶提工艺中各个单因素的最优范围：温度40～50℃，提取时间6～8h，酶用量0.33～0.67mL/g干皮渣，pH4.4～5.2之间。

在单因素实验的基础上，运用二次通用旋转实验设计，并以Design Experts软件进行数据分析，确定了酶提工艺的数学模型及最优工艺参数，在提取温度47.5℃，提取时间6.66h，酶用量0.56mL/g干皮渣，pH4.95下，橙皮果胶的得率达到了14.79%，与预测值14.43%基本一致，说明模型是可靠的。

本实验选用的纤维素酶与先前研究中的所用酶相比价格低廉，大大降低了酶法提取果胶的成本。将本实验所得酶法提取工艺参数用于橙皮果胶提取中，果胶的得率为14.79%，高于同类研究中2008年Zykwinska使用的诺维信产纤维素酶提柑橘果胶得率12.6%，高于2009年苏艳玲［15］研究中的选用的纤维素酶提取柑橘果胶得率的6.109%，因此不同的来源的纤维素酶在提取果胶时具有差异，实际工业生产中选用不同的纤维素酶时需分别进行研究。此外酶法提取果胶工艺是在温和的条件下操作，比传统高酸、高温提取工艺安全，且所得果胶色浅，适用的范围将会更广，干燥后容易粉碎。近几年的研究报道也发现酶法提取的果胶在成分组成、酯化度、半乳糖醛酸含量方面不同于传统工艺提取果胶，本实验采用此纤维素酶所得果胶的品质也有待于进一步的研究。

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Cellulase extraction of pectin from orange peel

HAN Dong-mei，LIAO Xiao-jun，LI Shu-yan，HU Xiao-song，WU Ji-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Engineering Research Centre for Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Education，Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China）

The characteristics of cellulase system is complicated，cellulase from different sources act with different effects in pectin extraction.The extraction of pectin from orange peel by cellulases which was different from the ones in literatures was studied.One kind of low-cost cellulase suitable for pectin extraction was screened out from three kinds of cellulases.And the effects of extraction pH，temperature，time，enzyme concentration on the pectin yield were studied by quadratic regression rotational composite design.The best effective factors were determined.Via statistical software of Design Expert analysising，the model was significant and the lack of fit was not significant with obvious statistical significance.The optimal combination forecasting model was drew on volume of enzyme 3.38mL，time 6.66h，temperature 47.5℃，pH4.95，pectin yield of forecasting model was 14.43%and verification experiment was 14.79%.Pectin yield was improved greatly and much higher than the reported in literatures，and cellulose was low-cost，so cost of production can be saved greatly.

orange peel；pectin；cellulose；quadratic regression rotational composite design

TS201.7

B

1002-0306（2011）02-0183-04

果胶作为一种食品添加剂，以其良好的胶凝性、稳定性、增稠性、优良的口感、低糖和低热量等性能受到人们的青睐。FAO/WHO食品添加剂联合委员会推荐果胶为不受添加量限制的安全食品添加剂。酶法提取柑橘皮中的果胶是继传统酸法［1-2］、微波方法［3-5］之后的另一种新颖的提取方法，具有提取条件温和，操作安全，不污染环境等优点，被誉为“绿色生产”。酶法提取果胶用酶根据橘皮材料的构成，较多采用纤维素酶进行研究，由于不同菌种、培养条件的差异，导致纤维素酶系的构成比例不同［8］，导致不同的纤维素酶对皮渣的综合作用不同，并且国内外在酶法提取果胶的研究中，普遍存在提取用酶的成本高［6-8］，难以实现产业化的问题，本文通过酶的筛选，选取了一种价格低廉、适合果胶提取的纤维素酶进行研究，以期为酶法提取果胶技术的进一步研究提供参考。

2010-02-25 *通讯联系人

韩冬梅（1983-），女，在读硕士研究生，研究方向：果蔬加工。

国家863计划（2007AA10Z307）。