李 雪，尤 娟，罗永康

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

草鱼肉蛋白酶解物功能特性及质量控制的研究

李 雪，尤 娟，罗永康*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

采用Neutrase对草鱼鱼肉蛋白进行了酶解，得到了水解度（DH）为4.72%、9.80%、13.32%的酶解产物（NH），并分析了pH与水解度对酶解产物功能特性的影响。结果表明，酶解产物的溶解性、乳化性、起泡性在pH为4时达到最低，而后随pH的增大而增加。在pH为3～8的范围内随水解度的增加，酶解产物的溶解性增加，起泡性降低。pH为4时，水解度为4.72%、9.80%、13.32%的酶解产物的热稳定性之间存在显著性差异（P＜0.05），且随水解度升高而增大。在pH为3～5的范围内酶解产物的乳化性随水解度升高而降低。酶解产物的溶解性、乳化性、起泡性间存在相关性（P＜0.05）。

草鱼，水解，功能特性

1 材料与方法

1.1 材料与设备

草鱼 购于北京健翔桥农贸市场，活体运至实验室，去鳞、去内脏、去头、去骨、洗净后进行采肉（取白肉），用搅碎机搅成肉糜；三硝基苯磺酸（TNBS） 美国Sigma公司；Neutrase 丹麦NOVO公司；鲁花牌5S压榨花生油 市售；其他所用试剂 均为化学分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 草鱼鱼肉蛋白水解产物的制备工艺 草鱼肉糜→与水混合→灭内源性酶（90℃、15min）→均质→调温度、pH→加中性蛋白酶酶解→灭酶（90℃、10min）→离心（3600r/min、20min）→取上清液→冷冻干燥→草鱼鱼肉蛋白水解产物

1.2.2 水解产物成分的测定 蛋白质含量的测定：凯氏定氮法［7］；脂肪含量的测定：索氏抽提法（GB5497-85）；水分含量的测定：105℃恒重法（GB5512-85）；灰分含量的测定：550℃灼烧法（GB5505-85）。

1.2.3 水解度的测定 采用三硝基苯磺酸法（Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）［8-9］：将样品用1%十二烷基硫酸钠（SDS）稀释至一定浓度（1L样品中含有的氨基当量为0.25×10-3～2.5×10-3）。取0.25mL的样品混合2.00mL pH8.2磷酸缓冲溶液和2.00mL 0.1%TNBS溶液，于50℃暗室中反应60min。反应完毕之后，立即用4.00mL 0.1mol/L HCl终止反应，接着在室温下放置30min，于420nm下测其吸光值，在0～2.5×10-3mol/L L-亮氨酸的范围内作标准曲线。水解度的计算公式如下：

式中，AN1：未水解样品中每克蛋白含有的氨基当量（mmol/g蛋白）；F1：未水解样品的稀释倍数；AN2：水解样品中每克蛋白含有的氨基当量（mmol/g蛋白）；F2：水解样品的稀释倍数；htot：每克原料蛋白质的总的肽键毫摩尔数，本研究采用鱼肉为原料取htot=8.6。

1.2.4 功能特性的测定

陇西县是甘肃省43个国家级贫困县之一，全省58个扶贫重点县之一，整体属于六盘山等14个连片扶贫开发区域，2017年全省减少贫困人口67万人，贫困发生率由14.2%下降到9.6%，2017年陇西县贫困发生率依然是12.4%（回退前），贫困面还很大。如何继续深入实施东西部扶贫协作，精准扶贫、精准脱贫，实现到2020年现行标准下农村贫困人口实现脱贫，解决区域性整体贫困意义重大。

1.2.4.1 溶解性的测定 称取0.01g水解产物，用去离子水配制成10mL溶液，用浓度为1mol/L HCl或NaOH将溶液 pH调节到 3、4、5、6、7、8，然后在10000r/min离心15min，上清液中的蛋白质含量采用双缩脲法进行测定［10］。样品中总蛋白含量采用凯氏定氮法［7］测定。溶解性的计算公式如下：

1.2.4.2 热稳定性的测定 称取0.01g水解产物，用去离子水配制成10mL溶液，用浓度为1mol/L HCl或NaOH将溶液pH调节到4、7、8，然后在水浴锅中进行热处理（63℃、30min或93℃、30s），热处理后立即放入0℃冰水混合物中冷却10min，于10000r/min下离心15min。蛋白质热稳定性以热处理后的溶解性表示。

1.2.4.3 乳化性的测定［11］取1%的水解产物溶液3.0mL，边搅拌边加入花生油1.0mL，然后以10000r/min的速度高速匀浆1min制成乳浊液，用微量注射器从下部抽取0.1mL，加入9.9mL 0.1%的十二烷基磺酸钠（SDS）溶液制成混合液，在500nm的波长下测吸光度A0。乳化活性指数（EAI）计算公式如下：

式中，T=2.303；A0为乳化完成后立即测定的吸光度；W为蛋白质含量（g，乳化前水解产物的浓度）。

1.2.4.4 起泡性的测定［12］取20mL浓度为0.5%蛋白溶液，分别将其pH调至3、4、5、6、7、8，在均质机中以23000r/min转速搅拌1.5min，随后立即转入50mL的测量筒内测量搅拌后的体积。起泡性的计算公式如下：

式中，A为搅拌后的体积（mL）；B为搅拌前的体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 草鱼肉水解产物的化学组成

草鱼鱼肉蛋白酶解产物的化学组成如表1所示。

表1 草鱼鱼肉蛋白酶解产物的成分组成

2.2 水解度

采用TNBS法测定草鱼鱼肉蛋白的水解度，其水解度随时间的变化如图1所示。由图1可知，在最初的30min内，水解速率较高，随后水解速率逐渐降低。这与其他有关鱼肉蛋白水解的研究报道中水解速率的变化趋势相一致［13］。这一趋势表明在最初的30min内，中性蛋白酶对草鱼鱼肉蛋白的水解作用最强，随后水解体系中游离氨基酸含量增多，中性蛋白酶的水解作用逐渐受到抑制，水解速率减慢。

图1 草鱼肉蛋白酶解的水解度随时间的变化

2.3 水解产物的功能特性

2.3.1 溶解性 pH及水解度对蛋白酶解产物溶解性的影响在国内外研究中都有报道，对黄色条纹鲹、沙丁鱼副产物、鲢鱼肉等酶解产物的研究［1，13-14］表明，酶解可以有效改善原料蛋白的溶解性，酶解产物在不同的pH下均具有良好的溶解性，并且随着水解度的增加，酶解产物的溶解性增大，pH对酶解产物溶解性影响变小。对草鱼鱼肉蛋白酶解产物溶解特性的研究也得到了与上述报道相似的结论。

不同水解度草鱼鱼肉蛋白水解产物的溶解性能如图2所示。从图2可以看出，草鱼鱼肉蛋白酶解产物在pH为3～8的范围内均具有较好的溶解性，溶解性大于82%。在pH为4时不同水解度酶解产物的溶解性均达到最低，而后随 pH增加而增大。Quaglia［14］等在研究中指出，pH会影响酶解产物肽段的静电荷数量，从而导致溶解性发生变化。在相同pH下水解度较高的酶解产物溶解性较好。Shahidi［15］等在研究中指出，随着水解度的增加，水解体系中小肽的含量增多，原料蛋白中越多的极性基团被暴露，水解产物的亲水性增加，因此水解产物溶解性增加。

图2 溶液pH对草鱼鱼肉蛋白酶解产物溶解性的影响注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解产物的

溶解性之间差异不显著，P＞0.05。

2.3.2 热稳定性 以蛋白水解产物为基料或食品添加剂的食品在其加工过程经常要经过高温处理，蛋白质在加热过程中分子间的各种作用力被破坏，蛋白质分子构象发生变化，疏水基团暴露，进而发生凝集，溶解性下降。因此水解产物的热稳定性是衡量其是否适于在食品中应用的一个重要指标。

蛋白质分子经水解后肽链展开，亲水-疏水平衡得到改善，更易与水分子形成氢键，因此水解产物经热处理后不易发生分子间的凝集，溶解性可保持在较高水平。由图3、图4可知，在pH为4时，随着水解度的增加，酶解产物的热稳定性增加（P＜0.05），pH为7、8时，不同水解度酶解产物的热稳定性差异不显著（P＞0.05）。除DH=4.72%的水解物外，其它两水解度的水解产物经63℃、30min，93℃、30s热处理后均具较好的热稳定性，溶解性保持在82%以上。赵玉红［16］对鲢鱼下脚料进行酶解，所得酶解产物也具有较好的热稳定性。

图3 63℃、30min热处理条件下草鱼鱼肉蛋白酶解产物的热稳定性

2.3.3 乳化性 乳化活性指数是衡量蛋白质乳化性的常用指标。草鱼鱼肉蛋白中性蛋白酶酶解产物在水解度为4.72%、9.80%、13.32%时的乳化性如图5所示。水解产物的乳化性在pH为4时达到最低，而后随着pH的增加而增大。在pH为3～5的范围内酶解产物的乳化性随水解度的升高而降低。

图4 93℃、30s热处理条件下草鱼鱼肉蛋白酶解产物的热稳定性

图5 pH对草鱼鱼肉蛋白酶解产物乳化活性指数的影响注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解产物的乳化活性指数之间差异不显著，P＞0.05。

酶解对水解产物乳化性的影响已有一些报道。蛋白质被水解后，分子内部的疏水残基暴露，蛋白质在油-水界面吸附、扩散能力提高，乳化能力增强。Rahali［17］在研究中指出，肽段的长度和两亲性是影响酶解产物乳化性的重要因素。Klompong［1］等在有关水解度对酶解产物乳化性影响的研究中指出，较高的水解度会导致水解产物中小分子的肽和游离氨基酸含量增多，使蛋白质在油-水界面吸附、扩散的能力下降，导致乳化性有所下降。

2.3.4 起泡性 由图6可知，中性蛋白酶不同水解度酶解产物的起泡性均在pH为4时达到最低，而后随着pH的增加起泡性增强。与本研究相似，Klompong［1］以黄条纹鲹为原料、董士远［13］以鲢鱼鱼肉为原料、Qian［18］以猪血浆蛋白为原料所得的酶解产物在溶解性最低的pH下起泡性也达最低。Qian［18］等在研究中指出，酶解产物的溶解性较差时，蛋白质无法迅速地转移到分界面，导致酶解产物的起泡性也较弱。本研究与 Klompong［1］、董士远［13］、Qian［19］等对酶解产物起泡特性的研究报道基本相似，在相同pH下，随水解度的增加酶解产物的起泡性降低。这可能是因为随着水解度增加，蛋白质分子的肽段变短、分子量下降，其在界面上的展开和重排受到影响，起泡性降低。

3 结论

3.1 Neutrase酶解草鱼鱼肉蛋白产物在pH为3～8的范围内溶解性均大于82%，在pH为4时除DH= 4.72%的酶解产物外，其他两水解度的酶解产物经63℃、30min，93℃、30s热处理后均具有较好的热稳定性。

3.2 在pH为3～8的范围内酶解产物的溶解性、乳化性、起泡性随pH的变化趋势一致：在pH为4时达到最低，而后随pH的增加而增大。并且在pH为3～8范围内酶解产物的溶解性、乳化性、起泡性间存在相关性（P＜0.05）。

图6 pH对草鱼鱼肉蛋白酶解产物起泡性的影响注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解产物的起泡性之间差异不显著，P＞0.05。

3.3 采用中性蛋白酶酶解改性的草鱼鱼肉蛋白功能特性良好，可作为食品基料或蛋白强化剂应用于食品工业中。

［1］Klompong V，Benjakul S，Kantachote D，et al.Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe Trevally（Selaroides leptolepis）as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type［J］.Food Chemistry，2007，102（4）：1317-1327.

［2］Wasswa J，Tang J，Gu X H，et al.Influence of the extent of enzymatic hydrolysis on the functional properties of protein hydrolysate from grass carp（Ctenopharyngodon idella）skin［J］. Food Chemistry，2007，104：1698-1704.

［3］李娜，赵谋明，任娇艳.鳙鱼酶解可溶性蛋白营养特性及品质的研究［J］.现代食品科技，2009，25（5）：496-473.

［4］阎欲晓.罗非鱼活性肽分离及抗氧化能力研究［J］.水产科学，2009，28（5）：276-279.

［5］Wang L Z，Yang B，Du X Q.Extraction of acid-soluble collagen from grass carp（Ctenopharyngodon idella）skin［J］. Food Process Engineering，2009，32（5）：743-751.

［6］Wasswa J，Tang W，Gu X H.Functional properties of grass carp（Ctenopharyngodon idella），Nile perch（Lates niloticus） and Nile tilapia（Oreochromis niloticus）skin hydrolysates［J］. Food Properties，2008，11（2）：339-350.

［7］范天吉.乳和乳制品分析检测与执行标准实务全书［M］.呼和浩特：内蒙古人民出版社，2003：209-227.

［8］Alder-Nissen.Determination of the degrees of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitribenzenesulfonic acid［J］. Agricultural and Food Chemistry，1979，27（6）：1256-1263.

［9］Spellman D，McEovy E，Cuinn G O，et al.Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein：comparison of the TNBS，OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis［J］.International Dairy，2003，13：447-453.

［10］杨建雄.生物化学与分子生物学实验技术教程［M］.北京：科学出版社，2002：33-34.

［11］Pearce K N，Kinsella J E.Emulsifying properties of proteins：evaluation of a turbidimetric technique［J］.Agricultural and Food Chemistry，1978，26：716-723.

［12］Sathe S K，Salunkhe D K.Functional properties of the great northern bean（PhaseolusvulgarisL.）proteins：emulsion，foaming，viscosity and gelation pmpenies［J］.Food Science，1981，46：71-81.

［13］董士远，汪东风.两种酶水解鲢鱼蛋白水解产物的研究［J］.食品科学，2008，29（12）：94-100.

［14］Quaglia G B，Orban E.Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysatis from Sardine［J］. Science of Food&Agriculture，1987，38：271-2761.

［15］ShahidiF，HanX Q，SynowieckiJ.Productionand characteristics of protein hydrolysates from capelin（Mallotus villosus）［J］.Food Chemistry，1995，53：285-293.

［16］赵玉红.鱼蛋白水解物功能特性的研究［J］.东北农业大学学报，2001，32（2）：105-110.

［17］Rahali V，Chobert J M，Hatertle T，et al.Emusification of chemical and enzymatic hydrolysates of lactogobulin：characterization of the peptids adsorbed at the interface［J］. Nahrung，1997，44：89-95.

［18］Liu Q，Kong BH，Xiong Y L，et al.Antioxidant activity and functional properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of hydrolysis［J］.Food Chemistry，2010， 118：403-410.

Functional properties and quality control of protein hydrolysates from grass carp fish（Ctenopharyngodon idellus）meat

LI Xue，YOU Juan，LUO Yong-kang*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Functional properties of protein hydrolysates from grass carp fish（Ctenopharyngodon idellus）meat，

hydrolyzed by Neutrase（NH）at 4.72%，9.80%and 13.32%of degree of hydrolysis（DH）were investigated.The solubilities，emulsion activity index and foaming capacity were the lowest at pH4.With the DH rising，the solubilities of hydrolysates increased，but the foaming capacity decreased in the pH range of 3～8.The NH displayed a lower heat stability with the DH rising at pH4（P＜0.05）.As the DH rise，the emulsion activity index decreased in the pH range of 3～5.And there were significant relationship between solubility，emulsion activity index and foaming capacity（P＜0.05）.

grass carp；hydrolysis；functional properties

TS254.1

A

1002-0306（2011）02-0081-04

我国淡水鱼资源丰富，产量位居世界第一，但我国淡水鱼的加工利用率却不足10%。近些年来国内外已有一些采用酶解的方法对鱼蛋白进行深加工利用的研究报道［1-4］。酶解后的鱼蛋白产物是多肽、小肽和氨基酸组成的复杂体系，其与原料蛋白具有相同的氨基酸构成，而功能特性及生物活性与原料蛋白相比却得到了一定的改善。酶解产物的功能特性受原料蛋白理化特性、水解度、所选用酶种类等的影响。因此开展鱼蛋白酶解产物功能特性的研究对淡水鱼的深度开发及鱼肉蛋白酶解产物在食品中的应用具有重要意义。草鱼（Ctenopharyngodon idellus），俗名鲩鱼，蛋白质含量为15%～20%，是我国第一大淡水鱼。目前国外对于草鱼开发利用的研究报道较少［2，5-6］，国内对于草鱼开发利用的报道侧重于草鱼酶解工艺、胶原蛋白提取工艺等的研究，未见对草鱼鱼肉蛋白酶解产物功能特性进行系统研究的报道。本研究采用中性蛋白酶提取草鱼鱼肉蛋白水解物，并对其溶解性、热稳定性、乳化性、起泡性进行系统的研究，分析溶解性、乳化性、起泡性间的相关性，为扩大草鱼鱼肉蛋白在食品工业中的应用提供了理论依据。

2010-03-25 *通讯联系人

李雪（1987-），女，硕士研究生，主要从事畜水产食品加工研究。

现代农业产业技术体系建设专项资金资助（nycytx-49-24）；国家自然科学基金项目（30871946）；国家科技支撑计划（2008BAD94B06）。