胡晓波,郭海艳,胡传玺,瞿跃红,李 漫,王 瑛,张建军

(1.上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科,上海201900;2.上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海200011)

鲍曼不动杆菌是造成院内感染的重要条件致病菌,可引起广泛的严重感染[1]。近年来随着抗生素的大量使用,鲍曼不动杆菌的耐药率逐步上升,并已有广谱耐药鲍曼不动杆菌的出现,给临床治疗带来极大困难[2]。研究显示,在耐药鲍曼不动杆菌中检测到的多数耐药基因常位于整合子基因盒中。整合子是细菌基因组中的可移动遗传物质,可将许多耐药基因整合在一起,从而形成多重耐药[3]。其中 I类整合子在杆菌的耐药中扮演着重要的角色。I类整合子的结构由5-CS、3-CS及中间的可变序列组成。5-CS携带编码整合酶基因int I和一个启动子基因片段,3-CS包括3个开放阅读框架(ORF):季铵盐化合物溴乙锭耐药基因(qacEA1)、磺胺耐药基因(sul I)和功能尚不清楚的ORF[4-8]。

本实验收集临床分离的鲍曼不动杆菌株,用M IC法检测鲍曼不动杆菌的耐药性,然后采取PCR法检测I类整合子的基因。针对I类整合子保守序列设计扩增引物,将整合子可变区域的全长序列扩增出来,分析得到插入 I类整合子中对应的耐药基因。最后统计分析耐药组和不耐药组的差异性。本研究希望能建立一种快速简便的I类整合子检测方法,监测鲍曼不动杆菌的耐药性及耐药基因携带情况,及时发现新的耐药基因,指导临床用药、促进感染的恢复、减少滥用抗生素。

1 材料和方法

1.1 试验菌株 收集上海交通大学医学院附属第三人民医院2007年9月至2009年9月从痰液、尿液、咽拭和引流液等标本分离的多重耐药鲍曼不动杆菌共63株。标准菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)。

1.2 菌株培养和分离 用麦康凯血平板培养分离出Gram阴性杆菌,采用生物梅里埃的Gram阴性菌鉴定板条鉴定鲍曼不动杆菌。M IC法检测鲍曼不动杆菌的耐药性,抗生素处理组包括:头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟、头孢呋辛、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林+棒酸、哌拉西林+他唑巴坦、替卡西林+棒酸、美洛培南、亚胺培南、复方新诺明、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、奈替米星、环丙沙星。

1.3 细菌DNA的提取 从血平板上挑取单个菌落,加入到50μl双蒸水中,制成细菌悬液,100℃水浴10 min。然后以10 000 rpm/min离心5 min,取1 μl上清液作为DNA模板。

1.4 I类整合子 PCR扩增 整合子引物序列:Sense 5′-TCTCG GGTAA CATCA AGG-3′,antisense 5′-AAGCA GACTT GACCT GA-3′。扩增条件:95℃预变性5 min,然后94℃30 s,60℃30 s,72℃1min,循环30次,最后72℃延伸10min。

1.5 PCR产物的纯化和测序 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,120mV 1 h,溴化乙啶染色,在透射紫外仪下照相观察。随后对凝胶当中的PCR产物进行切胶回收并送出测序。测序结果在GenBank网上比对查询。

1.6 统计学方法 用Fisher确切概率计算法对整合子阳性与整合子阴性鲍曼不动杆菌的耐药率进行比较,统计两者差异是否有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增I类整合子基因

63株鲍曼不动杆菌中整合子阳性35株(56%),整合子阴性28株(44%),PCR扩增片段长度均约为2 300 bp。图1当中列出了1-16号鲍曼不动杆菌样本中I类整合子的扩增结果。

图1 1-16号鲍曼不动杆菌样本中I类整合子的扩增结果

2.2 药物敏感实验结果 I类整合子阳性菌株对11种抗生素耐药率高于 I类整合子阴性菌株,耐药率见表1。显示整合子阳性菌株对头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟、头孢呋辛、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林+棒酸、哌拉西林+他唑巴坦、替卡西林+棒酸、复方新诺明、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、奈替米星、环丙沙星均耐药。整合子阴性菌株对头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、环丙沙星、阿莫西林、哌拉西林耐药。整合子阳性和阴性的鲍曼不动杆菌对6种都耐药的抗生素(头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、环丙沙星、阿莫西林、哌拉西林)和2种都敏感的抗生素(亚胺培南、美罗培南)差异均无统计学意义。

2.3 产物序列分析 PCR产物经凝胶回收纯化后进行测序,实际长度为2 347 bp。经Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)网站BLAST比对后,在 I类整合子可变区共有3个耐药基因盒:aaeA4、catB8和aadA1,其中aaeA4,aadA1导致鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类的耐药,catB8则导致了其对氯霉素的耐药性。

3 讨论

鲍曼不动杆菌是造成院内感染的重要条件致病菌,广泛存在于自然界和人体表面。氨基糖苷类药物与β内酰胺类药物联合用药曾是治疗鲍曼不动杆菌感染的有效药物。但是近年来随着抗生素的大量使用或滥用,鲍曼不动杆菌的耐药率逐步上升[1],甚至出现了对Gram阴性杆菌抗菌谱药物全部耐药的菌株,称为泛耐药鲍曼不动杆菌,成为医院感染的一种重要的病原菌[2]。近年来临床分离的鲍曼不动杆菌对头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类常用抗菌药物出现多重耐药性.甚至对碳青烯霉类药物也出现耐药,致严重的院内感染,给临床治疗带来极大困难。

鲍曼不动杆菌的耐药机制非常复杂,包括产生多种β内酰胺酶、氨基糖苷类药物修饰酶、外膜蛋白丢失、青霉素结合蛋白改变和泵出等[9]。在耐药鲍曼不动杆菌中检测到的多数耐药基因常位于整合子基因盒中。整合子是细菌基因组中的可移动遗传物质,携带位点特异性重组系统组分,可将许多耐药基因整合在一起,从而形成多重耐药[3]。整合子共分为6类,其中I类整合子分布最为广泛,在杆菌的耐药机制中扮演着非常重要的角色。I类整合子的可变区域中常常携带有重要的抗性基因.包括氨基糖苷类修饰酶基因、金属酶基因和超广谱的β内酰胺酶基因等,通过对 I类整合子基因盒中携带的外源基因的检测,使我们有可能更深入地了解鲍曼不动杆菌的耐药机制。

表1 I类整合子阳性与阴性鲍曼不动杆菌耐药率比较

我们对I类整合子可变区的序列进行分析后发现,整合子中包括1个aacA4,catB8和1个aadA1的基因盒。其中aaeA4,aadA1导致鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类的耐药,catB8编码对氯霉素的耐药性。但同时我们也看到,I类整合子阴性的鲍曼不动杆菌对许多抗生素也表现出了较强的耐药性,这些结果表明,除了I类整合子外,我院鲍曼不动杆菌发生多重耐药可能还与其它耐药机制有关。研究临床鲍曼不动杆菌的耐药机制,加深对细菌多重耐药的发生和转移机制的了解,有助于做好细菌耐药性的控制工作。同时更重要的是加强临床细菌耐药性发生和发展的监控,合理使用抗菌药物,延缓细菌耐药性的产生。

[1]Hello SL,Falcot V,Lacassin F,etal.Risk factorsfor carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infectionsat a tertiary care hospital in New Caledonia,South Pacific[J].Scand J Infect Dis,2010,21(Epub).

[2]Le Hello S,Falcot V,Lacassin F,et al.Molecular epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in New Caledonia[J].Clin Microbiol Infect,2008,14:977.

[3]Chiu CH,Lee HY,Tseng LY,et al.Mechanisms of resistance to ciprofloxacin,ampicillin/sulbactam and imipenem in Acinetobacter baumannii clinical isolates in Taiwan[J].Int J Antimicrob Agents,2010,35:382.

[4]Ramirez MS,Bello H,Gonzalez Rocha G,et al.Tn7::In2-8 dispersion in multidrug resistant isolatesof Acinetobacter baumannii from Chile[J].Rev Argent Microbiol,2010,42:138.

[5]Lee YT,Huang LY,Chen TL,et al.Gene cassette arrays,antibiotic susceptibilities,and clinical characteristics of Acinetobacter baumannii bacteremic strains harboring class 1 integrons[J].JMicrobiol Immunol Infect,2009,42:210.

[6]Long YB,Faoagali J,Bodman J,etal.Persistenceofmultiple antibiotic resistant strains of Acinetobacter baumannii carrying class 1 integron in a hospital setting[J].Microb Drug Resist.2009,15:167.

[7]Sirichot S,Diraphat P,Utrarachkij F,et al.Dissemination of class Iintegron in Acinetobacter baumliannii isolated from ventilator-associated pneumonia patients and their environment[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health,2009,40:1284.

[8]Mak JK,Kim MJ,Pham J,et al.Antibiotic resistance determinants in nosocomial strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J].J Antimicrob Chemother,2009,63:47.

[9]Zavascki AP,Carvalhaes CG,Picao RC,et al.Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii:resistance mechanisms and implications for therapy[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2010,8:71.