刘亚南，张志胜，孙克岩，佟海菊，宋 欣

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

中性蛋白酶酶解提取牡蛎牛磺酸工艺条件研究

刘亚南，张志胜*，孙克岩，佟海菊，宋 欣

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

研究了中性蛋白酶酶解温度、加酶量、pH、料液比对牡蛎中牛磺酸提取工艺条件的影响。结果表明：酶解温度40℃，加酶量1000u/g，pH7.2，料液比1∶9（g/L），在此条件下酶解5h，测得牛磺酸提取量达到2.623mg/g。

中性蛋白酶，牡蛎，牛磺酸

牛磺酸又名牛胆酸，是人体非必需氨基酸之一。牛磺酸主要以游离形式广泛存在于动物的组织细胞内[1]。在海洋生物中含量尤为丰富，据文献报道[2]，每千克鲜牡蛎中含牛磺酸约4～8g。牛磺酸具有广泛的生理功能，如参与渗透调节、抗氧化、解毒和刺激糖酵解等[3]，对维持机体的正常生长发育、中枢神经系统、心血管系统、视觉系统、血液、免疫和生殖系统的功能有着重要的作用[4-6]。目前，国内外牛磺酸的制取多采用化学合成，但化学合成成本高，污染严重，因此从天然产物中提取牛磺酸备受关注。牡蛎为我国四大经济贝类之一，营养丰富，富含氨基酸、蛋白质、维生素及微量元素等[5-6]，近年来对牡蛎中牛磺酸的提取多采用水煮法。本文以牡蛎为原料，利用中性蛋白酶酶解提取，以牛磺酸提取量为指标，确定了中性蛋白酶的最适宜酶解工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡蛎 由唐山丰瑞水产食品有限公司提供；枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（以下称中性蛋白酶，标注酶活为60000u/g） 索来宝科技有限公司；牛磺酸标准样（≥99%） 上海蓝季科技发展有限公司；其他试剂 均为分析纯。

UV2800H紫外分光光度计 尤尼科（上海）仪器有限公司；HH-4电热恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司；DELTA320精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；79-1磁力搅拌器 金坛市医疗仪器厂；JJ-2组织捣碎均浆机（2003-61） 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；GL2G2Ⅱ立式冷冻离心机上海安亭科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛磺酸提取方法[7]新鲜牡蛎肉清洗均浆，称取一定量的均浆肉，按照实验设计方案确定的实验参数调整酶解温度、加酶量、pH、料液比，将均浆液在水浴锅中预热15min，然后按照实验设计方案添加中性蛋白酶恒温酶解5h，期间每10min用玻璃棒搅拌一次，酶解完成后样品在沸水浴中灭酶10min，冷却，在6000r/min下离心15min，取上清液测定牛磺酸含量。

1.2.2 牛磺酸含量测定

1.2.2.1 牛磺酸检测方法[8]在醋酸钠的作用下，牛磺酸与乙酰丙酮和甲醛加热反应生成黄色配合物，其吸光度与牛磺酸的浓度在一定范围内呈正比。显色剂的配制：10mL NaAC（1mol/L）、0.6mL乙酰丙酮、0.4mL甲醛用水定容至25mL。测定时在10mL试管中加入1mL样液，1.5mL显色剂和2.5mL水，用棉塞封住口，100℃下水浴15min，冷却后在400nm下测定牛磺酸含量。

1.2.2.2 标准曲线的测定 取不同量的牛磺酸标准溶液，按照实验方法，加入显色剂显色，发现牛磺酸浓度在0～0.3mg/mL范围内与吸光度呈线性关系，拟合线形方程为y=2.0207x+0.0054，R2=0.9989。

1.2.3 牛磺酸提取工艺条件的优化 根据单因素实验结果，采用L9（34）正交表，以温度、加酶量、pH、料液比选取四因素三水平进行实验，并对结果进行方差分析及显著性检验，以确定最佳的提取工艺条件，各因素水平如表1所示。

表1 中性蛋白酶酶解正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 影响牛磺酸提取量的单因素实验

2.1.1 温度对牛磺酸提取量的影响 在加酶量1200u/g，pH7.2，料液比1∶9的条件下，酶解5h，不同酶解温度对牛磺酸提取量的影响如图1所示。由图1可知，在一定范围内，随着温度的升高牛磺酸提取量也随之增大，45℃时达到最大，为2.45mg/g，之后随提取温度继续升高，牛磺酸提取量呈降低的趋势。

图1 温度对牛磺酸提取量的影响

2.1.2 加酶量对牛磺酸提取量的影响 在温度45℃，pH7.2，料液比1∶9的条件下，酶解5h，不同加酶量对牛磺酸提取量的影响如图2所示。由图2可知，随着加酶量的增加，牛磺酸提取量也随之增加，加酶量在1200u/g时，增幅量最大，此时牛磺酸提取量为2.50mg/g，随后趋于平稳。因此，为节省成本选取加酶量为1200u/g。

图2 加酶量对牛磺酸提取量的影响

2.1.3 pH对牛磺酸提取量的影响 在温度45℃，加酶量1200u/g，料液比1:9的条件下，酶解5h，不同pH对牛磺酸提取量的影响如图3所示。由图3可知，随着pH的升高，牛磺酸提取量也随之升高，在pH为7.2左右时达到最大，约为2.63mg/g。但是随着pH的继续升高，提取量明显下降，因此选取pH为7.2。

图3 pH对牛磺酸提取量的影响

2.1.4 料液比对牛磺酸提取量的影响 在温度45℃，加酶量1200u/g，pH7.2的条件下，酶解5h，不同料液比对牛磺酸提取量的影响如图4所示。由图4可知，随着提取液用量的增加，牛磺酸提取量不断缓慢升高，料液比为1∶9（g/L）时牛磺酸提取量为2.35mg/g，1∶11时为2.55mg/g。考虑到成本因素及提取后的纯化工作，料液比选为1∶9（g/L）。

图4 料液比对牛磺酸提取量的影响

2.2 中性蛋白酶酶解提取工艺优化结果

表2 L9（34）中性蛋白酶酶解实验方案与结果

中性蛋白酶酶解正交实验方案与结果如表2所示。由实验结果可知，牛磺酸含量最高的酶解工艺组合为A1B2C2D2，提取量可达2.62mg/g（鲜肉）。应用SPSS软件对正交实验方案进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，影响牛磺酸提取含量的主次因素是：温度＞pH＞料液比＞加酶量。显著性检验表明，温度、时间和料液比对牛磺酸提取量的影响都达到了极显著水平（p＜0.01），加酶量在实验因素水平范围内对实验没有显著性影响。正交实验中最适宜酶解工艺组合为A1B2C2D2，因素A、C、D对牛磺酸提取量都有显著性影响，因此因素A取40℃，因素C取7.2，因素D取1∶9（g/L）；因素B对实验无显著性影响，且加酶量从1000u/g到1200u/g，牛磺酸含量相差不大（加酶量为1000u/g时牛磺酸提取量为2.623mg/g，加酶量为1200u/g时牛磺酸提取量为2.628mg/g），考虑到节省成本，选取加酶量为1000u/g（鲜肉）。综上所述，中性蛋白酶酶解提取牛磺酸的最适宜工艺为：温度40℃，加酶量1000u/g（鲜肉），pH7.2，料液比1∶9（g/L）。

表3 中性蛋白酶酶解实验方差分析

3 结论

本文研究了中性蛋白酶酶解牡蛎提取牛磺酸的工艺条件，得出影响牛磺酸提取量的主次因素是温度、pH、料液比、加酶量。最佳工艺条件为：温度40℃，加酶量1000u/g（鲜肉），pH7.2，料液比1:9（g/L），在此条件下水解5h，牛磺酸提取量为2.623mg/g（鲜肉）。

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Study on extraction of taurine from oyster with neutral protease

LIU Ya-nan,ZHANG Zhi-sheng*,SUN Ke-yan,TONG Hai-ju,SONG Xin

（College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China）

The effect of the enzyme temperature，enzyme added，pH and soid-liquid was studied for extraction of taurine.The result indicated that the optimal technological conditions of extracting taurine was:hydrolysis at temperature 40℃，quantity of enzyme E/S=1000u/g，pH 7.2，solid and liquid ration 1∶9，hydrolisis time 5h.the yielding content of taurine was 2.623mg/g from the verifying experiment under this optimume condition.

neutral protease； oyster； taurine

TS254.1

B

1002-0306（2011）10-0308-03

2010－11－26 * 通讯联系人

刘亚南（1984-），女，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

国家海洋公益性行业科研专项（200805046）。