翟福丽，赖克强，张衍亮，黄轶群,*

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 201206)

动物性食品中β-兴奋剂残留概述

翟福丽1，赖克强1，张衍亮2，黄轶群1,*

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 201206)

β-兴奋剂能促进动物蛋白质的合成，提高饲料转化率，但其在动物性食品中的残留物给人的身体健康带来威胁，因此，多数β-兴奋剂在畜牧业中已被禁止使用，各国政府通过一系列法律法规限制该类药物的滥用以加大对β-兴奋剂的监管力度。通过介绍β-兴奋剂在动物性食品中的残留现状及常见的β-兴奋剂使用情况，比较主要国际组织和国家，包括国际食品法典委员会、欧盟、美国、日本和中国对β-兴奋剂最大残留限量、检测标准的异同，同时总结近年来β-兴奋剂残留的检测方法。

β-兴奋剂；最大残留限量；标准；检测方法

β-兴奋剂(β-agonist)全称β-肾上腺素受体激动剂(β-adrenoceptor agonist)，又叫β-激动剂，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物(phenethylamines，PEAs)(图1)[1]。按照苯环上取代基的不同，可将PEAs分为苯胺型和苯酚型：苯胺型PEAs结构中具有芳伯胺基，中等极性；苯酚型PEAs一般具有邻(间)苯二酚或苯酚结构，由于含有氨基和酚羟基，故极性高，苯酚型PEAs又可分为儿茶酚类、间苯二酚类和水杨醇类[2]。常见的β-兴奋剂为克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、非诺特罗、特布他林等，其结构式和类型如表1。

β-兴奋剂能选择性地与细胞膜上的β-肾上素受体结合，起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，因此在临床上常用于人和动物哮喘类病症的治疗[3]。20世纪80年代有研究表明，β-兴奋剂影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，使体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加，显著提高瘦肉率[4]。β-兴奋剂残留会聚集在动物可食用组织中，由于这类化合物具有口服活性，如果违法超量使用将会对人与动物的肝、肾等内脏器官产生毒副作用。最早被用于提高动物瘦肉率的β-兴奋剂是克伦特罗，但随着世界范围内对其禁用，莱克多巴胺、沙丁胺醇等成为克伦特罗最常用替代品，而其他β-兴奋剂如马布特罗和妥洛特罗等在20世纪90年代后才上市，相对用得较少。

表1 常见的β-兴奋剂Table 1 Commonly usedβ-agonists

图1 β-兴奋剂的基本结构Fig.1 Basic chemical structure ofβ-agonist

1 3种常见β-兴奋剂简介

克伦特罗(clenbuterol，CLB)又称克喘素，俗称“瘦肉精”，化学名为α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇，是最早发现的具有营养再分配作用并被大量非法使用的β-兴奋剂[1]。克伦特罗会在眼组织、肺组织、毛发中显著富集，食用组织中以肝、肾中残留最高，肌肉组织中最低。因此，国际上检测克伦特罗残留的样本主要以尿液和肝、肾、肌肉等食用组织为主[2]。有研究表明，长期摄入克伦特罗，可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤[5]。自1990年西班牙首次爆发消费者因食用残留有克伦特罗的牛肉导致中毒的严重事件以来，此类食品安全事件频繁发生。例如，2007年9月，上海市336人因食用了残留有克伦特罗的猪肉发生集体中毒事件，是上海市最大规模的克伦特罗中毒事件[6]；2009年2月，广东省70多人因食用猪的内脏引起中毒[7]。为了确保消费者食用安全，联合国粮农组织与世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会(The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)以药效动力学获得的最大无作用剂量(no observed effect level，NOEL) 0.04μg/kg体质量为基础，加上10倍的安全系数，建立的每日允许摄入量(acceptable daily intake，ADI)为 0～0.004μg/kg 体质量[2]。欧盟和美国先后在1988年、1991年禁止将克伦特罗作为兽药饲料添加剂，中国政府在1997年也明确禁止将该药物添加在饲料中使用。随着各个国家和组织对克伦特罗的限制和公共关注度提高，以及检测方法的不断完善和成熟，克伦特罗的使用得到了较好的控制，而克伦特罗替代品开始越来越多地添加于饲料中。

莱克多巴胺(ractopamine，RAC)，商品名称“培林”，其化学名为4-[3-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)-乙基]氨基丁基]苯酚，是瘦肉精的广泛替代产品[8]。莱克多巴胺代谢速度很快，平衡代谢研究表明，95%的莱克多巴胺代谢物能在摄入的前3d排出体外[8]。美国食品药品监督管理局(FDA)在1999年12月22日正式批准莱克多巴胺作为猪的饲料添加剂，另外有20多个国家如日本、澳大利亚、加拿大、巴西、泰国等也允许在饲养食用动物中使用莱克多巴胺[8]。美国规定：对于体质量为68～109kg的成猪，饲料中允许的添加量为5～20mg/kg；体质量大于109kg的成猪，只允许添加5～10mg/kg的莱克多巴胺[8]。JECFA在最大无作用剂量为67μg/kg体质量的基础上，建立的ADI为0～1μg/kg体质量[8]。由于莱克多巴胺能够促进动物蛋白质合成，提高饲料转化率，但对人的健康存在潜在的危害，因此包括欧盟、中国、马来西亚在内的150多个国家禁止使用莱克多巴胺促进动物生长[8]。由于不同国家在莱克多巴胺法规上存在差异，因此引起了许多贸易纠纷事件：如2007年5月中国查处了美国进口的猪肉，就是由于猪肉中含有莱克多巴胺残留引起的贸易纠纷；同年，台湾检出美国进口的猪肉有莱克多巴胺残留，引起争议[9]。

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)又名舒喘宁，化学名为4-羟基-5-羟甲基-α-(叔丁胺)甲基苯乙醇胺，用于治疗人的哮喘、慢性支气管炎等[10]。近年来不法分子将沙丁胺醇用于畜牧业中作为营养再分配剂，提高动物蛋白质合成。与克伦特罗相比，沙丁胺醇的促进作用略弱，体内清除时间较短，毒副作用也略弱，因此成为克伦特罗首选的替代品之一。但沙丁胺醇残留物对人体也有副作用，如肌肉战栗、心悸、头疼、目眩、恶心、呕吐等[11]。中国农业部235号公告[12]及农牧发[2002]1号文件[13]规定，禁止将沙丁胺醇及其盐、酯用于所有食用动物中。另外，中国农业部还明确规定禁止将西马特罗(cimaterol)用于所有食用动物中[13]。

2 国内外最大残留限量的制定

2.1 克伦特罗(CLB)

1996年第47届JECFA会议通过了关于克伦特罗最大残留限量标准的规定，即克伦特罗在马、牛肌肉和脂肪的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)为0.2μg/kg，在肾脏、肝脏中的MRLs为0.6μg/kg，在牛乳中为0.05μg/L，推荐的检测方法为气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)[14]。2003年，第26届国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission，CAC)决议通过了此标准，至今仍被采用。日本于2006年起实施“肯定列表制度”(Positive List System)，执行新的残留限量标准。其中，对克伦特罗残留标准实施“暂定标准”，即参考CAC标准，但又明确规定在猪的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪中，克伦特罗不得检出[15]。欧盟发布的克伦特罗最大残留限量标准(EC 2377/90)，均低于CAC标准，马、牛肌肉中的最高残留限量为0.1μg/kg，内脏中为0.5μg/kg。欧盟于2007年12月出台EC 16129/07条例，旨在制定更低水平的MRL，废除现行的标准，可见欧盟对克伦特罗残留要求更为严格(表2)，且越来越高。中国农业部于1999年在关于发布《动物性食品中兽药最高残留限量》的通知(农牧发[1999]17号)中规定克伦特罗在马、牛肌肉、内脏、肾脏及奶中的MRLs为0.1、0.5、0.5、0.05μg/kg[16]。但自2002年12月起，农业部第235号公告[12]修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，同时废除农牧发[1999]17号，新的公告规定，克伦特罗在所有动物性食品中不得检出。

表2 动物肌肉、内脏和牛乳中克伦特罗的最大残留限量Table 2 Maximum residue limits of clenbuterol in milk, animal muscles and organs μg/kg(*μg/L)

2.2 莱克多巴胺(RAC)

第62届JECFA会议制定了莱克多巴胺的残留标准，该标准规定了莱克多巴胺在牛和猪的肌肉、脂肪中的最大残留限量均为10μg/kg，肝脏中为40μg/kg，而肾脏中为90μg/kg，推荐的检测方法为液相色谱法(liquid chromatography，LC)[8]。同美国制定的最大残留限量标准相比，CAC对莱克多巴胺的限制较为严格。美国规定在猪肝脏中莱克多巴胺的最大残留量为150μg/kg，牛肝脏中为90μg/kg，猪肌肉中为50μg/kg，牛肌肉中为30μg/kg，均高于CAC残留标准[18]。日本肯定列表规定，莱克多巴胺残留标准仍然参照CAC标准制定(表3)。欧盟、中国禁止将莱克多巴胺用于畜牧业中，但目前尚未建立最大残留限量标准[8]。

表3 动物肌肉和内脏中莱克多巴胺的最大残留限量Table 3 Maximum residue limits of ractopamine in animal muscles and organs μg/kg

2.3 其他β-兴奋剂

世界各国对其他的β-兴奋剂也有相应的规定。例如，中国农业部235号公告[12]规定，沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯在所有动物性食品中不得检出；美国规定齐帕特罗(zilpaterol)在牛肝脏中最大残留限量为12μg/kg[19]。

3 国内外检测标准

3.1 国内标准

我国卫生部、农业部和国家质监总局发布了关于检测克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等β-兴奋剂的国家标准和行业标准(表4)[20-24]。其中GB/T 5009.192—2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》[20]，是修改采用了欧盟标准EUR 15127-EN“Veterinary Drug Residues,Residues in food producing animals and their products”(《动物性食品及其制品中兽药残留的分析》)。该标准确定了从酶联免疫法、高效液相色谱法定量到气质联机法确证和定量这一套方法用于我国动物性食品中克伦特罗残留的监控[20]。出入境检验检疫行业标准中优化了前处理方法，采用了C18和强阳离子交换柱(SCX)双固相萃取柱净化，LC-MS-MS检测，将克伦特罗的检出限提高到0.5μg/kg[22]，但是仍不能满足欧盟、CAC规定的动物肌肉中克伦特罗的残留不超过0.1～0.2μg/kg的标准。中国农业部1025号公告-18-2008《动物性食品中莱克多巴胺残留检测方法 酶联免疫吸附法》[23]中提出了检测多残留的液相色谱-串联质谱法，采用混合型阳离子交换固相萃取柱(MCX)柱萃取，将检出限提高到0.25μg/kg，仍然不能达到国际上对β-兴奋剂残留检测标准的要求[24]。

3.2 国外标准

欧盟对β-兴奋剂多残留的测定方法有两套。一套是筛选方法(screening methods) (Sg 2.1～2.4)：Sg 2.1和Sg 2.4是GC-MS方法；Sg 2.2是ELISA方法；Sg 2.3是酶免疫法。另一套是确证方法(confirmatory methods)(Cy 2.1～Cy 2.3)：Cy 2.1采用免疫亲和色谱柱(IAC)-GCMS测定生物样品和饲料中的β-兴奋剂；Cy 2.2用GCMS测定牛血浆和组织样品中的克伦特罗残留，液液萃取，经五氟丙酸酐衍生后，负离子化模式测定；Cy 2.3采用GC-MS测定牛尿中的β-兴奋剂残留，尿液样品中加入美托洛尔内标，N,O-双(三甲基硅基)-三氟乙酰胺衍生，正离子化学电离模式，检测每种β-兴奋剂的4个主要特征离子[25]。

美国农业部(USDA)于2004年发布了“ELISA Screening for β-Agonist Residues in Animal Retinal Tissue”《ELISA筛选检测动物组织视网膜组织中β-兴奋剂残留》(SOP：CLG-CLN3.01)。本方法适用于检测牛、羊、猪眼球视网膜组织中克伦特罗(检测水平≥3μg/kg)，牛、猪视网膜组织中沙丁胺醇(检测水平≥3μg/kg)、西马特罗(检测水平≥6μg/kg)。该方法采用一步提取步骤，切离的视网膜色素上皮与磷酸缓冲液(pH6.8)混合，经高速离心获取上清液，用酶联免疫试剂盒检测，依据650nm波长处光密度值计算分析物浓度[26]。USAD于2007年发布“Identification of Beta-Agonists by HPLCMS-MS”《高效液相色谱-质谱法检测β-兴奋剂》(SOP：CLG-AGON1.02，代替CLG-RAC1.01[27])标准，用于检测动物组织中残留的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗、齐帕特罗。本方法适用于检测牛的视网膜、牛猪羊肝脏和牛猪肌肉中克伦特罗、沙丁胺醇和西马特罗(检测水平≥3μg/kg)，齐帕特罗(检测水平≥6μg/kg)及莱克多巴胺(检测水平≥21μg/kg)[28]。

日本肯定列表中检测兽药残留方法为“HPLC兽药等同时检测方法I(畜、水产品)”，前处理方法为液液萃取法，克伦特罗的检出限为1μg/kg。肯定列表规定动物肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织中莱克多巴胺的检测方法为LC-MS。

4 检测方法

β-兴奋剂残留的主要检测方法有色谱法，如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用法(GCMS)、液质联用法(LC-MS)；免疫分析法，如酶联免疫法、胶体金免疫法、时间分辨免疫荧光测定等；毛细管电泳法及电化学法等。

表4 国内对β-兴奋剂的检测标准Table 4 Chinese standards ofβ-agonist analyses

4.1 色谱法

GC-MS是β-兴奋剂残留测定中最常用的定量和确证方法。由于β-兴奋剂的化学结构中有不易气化的羟基和氨基，因此需要对处理后的样品衍生化，常用的衍生化试剂有N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺和N,O-双(三甲基硅基)-三氟乙酰胺。GC-MS具有较高的特异性，但样品在进入质谱之前需要衍生化，其过程繁琐且耗时。因此，提高GC-MS检测方法的速度及灵敏度是近年来较为活跃的研究领域，如Daniele等[29]用较高的载气速度、快速升温(6.5min)实现了快速检测15种β-兴奋剂，同时降低了信噪比并保持了很好了色谱分离效果；Pasquale等[30]通过优化前处理方法大大提高检测的灵敏度，他们用固相萃取法(SPE)和α1-酸性蛋白(AAG)亲和色谱柱两步净化尿液中的克伦特罗及类似物，结合GCMS，将检出限提高到0.5μg/kg，且AAG亲和色谱柱稳定性好。

LC-MS-MS方法能提供更详细的结构信息，且背景干扰少，在特异性和灵敏性方面均优于GC-MS。但是LC-MS-MS设备价格昂贵，样品预处理较复杂，检测速度较慢。为了缩短前处理时间，提高β-兴奋剂的检出限，Crescenzi等[31]将基质固相分散技术与分子印迹固相萃取法相结合，提取净化牛肝脏中的克伦特罗，萃取速度快，回收率高达90%，结合LC-MS-MS，检出限＜0.1μg/kg。

4.2 免疫分析法

免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应为基础的分析技术。按照标记物或检测体系，免疫分析法可分为放射免疫分析法、酶联免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法[32]、胶体金免疫标记技术[33]、免疫传感器[34]、时间分辨免疫荧光测定[35]、毛细管电泳免疫分析等。

酶联免疫法(ELISA)是最常用的免疫分析技术，操作方便，检测迅速，欧盟将ELISA作为首选的筛选方法，但也存在着假阳性率较高、不能实现在线检测等缺点[1]。近年来，新的免疫技术如胶体金标记技术和时间分辨免疫荧光测定技术在生物学和医学领域已经成为有效的研究手段。胶体金标记法中，样品无需预处理，分析速度快，可实现在线检测，如Zhang等[33]用胶体金标记法快速、定量分析猪尿中残留的克伦特罗和莱克多巴胺，胶体金标记多抗后喷涂到玻璃纤维膜上，特异性抗原包被在硝酸纤维素膜上，制成快速检测试纸条，分析过程仅需要5min，检出限均为1μg/L。时间分辨免疫荧光测定用三价稀土离子及其鳌合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物[36]。该方法具有示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点。Bacigalupo等[35]用Eu3+标记的抗克伦特罗单克隆抗体，检出限为10μg/L。

免疫分析法一般作为筛选方法，所提供的待测物的结构信息太少，易出现假阳性，还需要采用其他方法对待测物进行定量和确证。

4.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析的液相分离技术[37]。该技术具有高分离效率(可达几百万理论塔板数)、低试剂耗费、操作灵活性高等优点。但进样量少限制了样品的浓度，从而降低了灵敏度，并且该方法分析时间长。为了缩短分析时间，Chen等[38]用毛细管区带电泳快速分离检测克伦特罗和沙丁胺醇，采用了60.5cm×75μm熔融石英毛细管，检测过程仅需要4.5min。为了提高检测灵敏度，Chen等[39]首次用安培检测法代替传统的紫外检测法，该方法在分离和检测多残留物质上有明显的优势，具有设备简单、成本低、检出限低等优点。他们将毛细管电泳技术与安培检测法结合，分离和检测3种常见的β-兴奋剂，克伦特罗的检出限为1μg/kg，沙丁胺醇为0.4μg/kg，西马特罗为0.5μg/kg。Chu等[40]用微型化的毛细管电泳-安培法检测克伦特罗和沙丁胺醇，与毛细管电泳-安培法相比，提高了分析速度，且该设备易携带。

4.4 其他方法

电化学分析法是将待测对象组成一个化学电池，通过测量电池的电位、电流、电导等物理量实现对待测物质的分析[37]。由于克伦特罗等化学结构式中含有电活性的芳香基团，因此可以用电化学法分析检测，如Guo等[41]首次用多壁碳纳米管修饰电极检测痕量的克伦特罗，此修饰电极表现出良好的稳定性、灵敏度、重现性和低检测限，克伦特罗检出限可达到0.1μg/kg。

另外，Liu等[42]根据克伦特罗对NaIO4氧化曙红有显著的催化效应，建立了超灵敏催化固体基质室温磷光法测定痕量克伦特罗的新方法，检出限达5.2×10-20g/mL；Visser等[43]用冷凝阱气相色谱-傅里叶变换红外光谱分析(GC-FTIR)β-兴奋剂多残留物，检出限为2.5μg/kg。

5 结 语

尽管国内外都建立了相应的法律法规限制β-兴奋剂的滥用，但仍有许多养殖户在饲料中添加该类药物，因此，由β-兴奋剂引起的食品安全事件时有发生。根据国内外对β-兴奋剂的监管及使用现状情况，建立全面、简单、快速的β-兴奋剂检测方法势在必行。检测方法的发展应主要集中在以下方面：样品预处理高效快速、溶剂耗费少；检测范围由单一检测转向多残留检测；深入研究仪器化操作简单、快速的检测方法。

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General Introduction to β-Agonists Residues in Foodstuffs of Animal Origin

ZHAI Fu-li1，LAI Ke-qiang1，ZHANG Yan-liang2，HUANG Yi-qun1,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Thermo Fisher Scientific(Shanghai) Co. Ltd., Shanghai 201206, China)

β-Agonists can increase protein synthesis rates and promote animal growth, but its residues in foodstuffs of animal origin may pose health risks to human. Most of β-agonists are banned to be used in animal feeds, and many countries have passed a series of laws and regulations to limit the use of β-agonists in animal feed and to enhance the control and monitoring of β-agonists used in farm animals. This article discusses the safety issues of β-agonist residues in foodstuffs of animal origin and compares the regulations on β-agonists among main international organizations and countries including Codex Alimentarius Commission, EU, USA, Japan and China, and summarizes the technologies used for qualitative and quantitative analyses of β-agonists.

β -agonists；maximum residue limit；standard；detection method

TS201.6

A

1002-6630(2011)05-0351-06

2010-07-13

上海市浦江人才计划项目(09PJ1405200)；上海市科学技术委员会支撑项目(09320503800)；

上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)

翟福丽(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：flzhai0818@gmail.com

*通信作者：黄轶群(1969—)，女，教授，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：yqhuang@shou.edu.cn