张 恒，邬应龙*

(四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

鸡骨蛋白酶解过程中的产物性质研究及电泳分析

张 恒，邬应龙*

(四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

研究风味蛋白酶酶解鸡骨过程中的氨基氮、可溶性氮、肽基氮的变化规律以及产物的呈味特性的变化趋势。结果表明：氨基氮和可溶性氮在酶解过程中逐渐增加，肽基氮增加到最大值后下降；酶解产物鲜味随时间延长而增加，苦味值在酶解后期逐渐稳定。游离氨基酸含量在24h达到最大值，呈味氨基酸的大量释放对酶解液的风味有重要影响。酶解液的Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示，在酶解过程中，多肽分子质量逐渐降低，酶解24h，酶解液分子质量约都集中在10.0kD以下。

鸡骨蛋白；酶解；呈味；氨基酸；Tricine-SDS-PAGE

随着我国肉鸡生产和加工业的加速发展，鸡骨架产量也逐年增加，但是由于我国新兴生产技术还不够成熟，对鸡骨的综合加工水平不高。近年来随着酶解技术在骨蛋白中的应用和发展，酶解产物作为营养基料、功能性基料和调味基料能应用在食品、化妆等许多领域。目前对鸡骨的酶解研究主要集中在水解工艺的优化[1-2]、酶解产物生理功能的研究[3]以及以酶解液作为肉味香精的前体经过美拉德反应制肉味香精调味基料等方面[4]。本实验在前期已优化酶解工艺的基础上，采用风味蛋白酶水解鸡骨蛋白，研究鸡骨酶解过程中的氨基氮、可溶性氮、肽基氮的变化和游离氨基酸的释放规律，以及酶解过程中产物的呈味变化趋势，并通过Tricine-SDS-PAGE方法分析了鸡骨蛋白在水解过程中多肽的降解情况，以期为鸡骨蛋白深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡骨架购于农贸市场。

风味蛋白酶 广西庞博生物公司；低分子质量标准蛋白(14.4～94.0kD)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、过硫酸铵、N,N,N＇N＇-四甲基乙二胺(TEMED) 美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；A-88型组织捣碎匀浆机 江苏省金坛市医疗仪器厂；手提式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；HHS-9S型恒温水浴锅 上海光地仪器设备有限公司；PHS-3C型酸度计 上海雷磁仪器厂；磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂；Mini-protean 垂直电泳槽美国Bio-Rad公司；日立L-8800氨基酸自动分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制备

取鸡骨架去除皮、油脂及肉，用粉碎机粉碎，将鸡骨泥与水1:1比例用组织匀浆机匀浆1min，配成质量分数10%的鸡骨悬浮液，在温度55℃、pH7.5、加酶量8000U/g pro的条件下酶解4、8、12、16、20、24h，酶解完毕后沸水灭酶10min，离心过滤，去除骨渣与悬浮物即为酶解液。

1.3.2 氮的3种存在形式的测定

氨基态氮含量的测定：酶解产物上清液中游离氨基酸含氮量占原料总氮量百分比，采用甲醛电位滴定法[5]。

可溶性氮含量测定：酶解产物上清液中总氮量占原料总氮量百分比，采用半微量凯氏定氮法。

肽基氮含量测定：酶解产物上清液中肽基氮量占原料总氮量百分比，肽基氮=可溶性氮－氨基态氮。

1.3.3 酶解产物呈味评价

结合文献[6-7]，将酶解液作为评尝对象，以蒸馏水为对比，评价其鲜味、苦味。评定小组由10人组成，均受过相关培训，打分采用5分制。评定前用清水漱口，将酶解液放入口中15s吞下，每个样品给两次，评定时拒绝交流，且样品需用带中性的文字标明，避免主观评价。

1.3.4 酶解产物游离氨基酸分析

游离氨基酸的分析：酶解液中加入等体积的7%磺基水杨酸，混匀后静置30min，去除蛋白质和多肽，于10000r/min离心20min，取上清液供氨基酸自动分析仪测定。

1.3.5 酶解产物电泳分析

SDS-PAGE电泳是测定蛋白质相对分子质量及亚基组成最常用的方法，该方法一般用于测定分子质量范围在10～200kD的蛋白质，而对于分子质量小于10kD的小分子多肽则不能有效地分离和测定，多采用Tricine-SDS-PAGE系统[8-9]，目前，在梅鱼、蛋清的酶解物分离上都有研究[10-11]。

凝胶的制备：经过多次摸索，鸡骨酶解液的电泳可采用两层胶的凝胶结构，在分离胶中加尿素和甘油，按表1灌胶。

表1 Tricine-SDS-PAGE电泳胶的组成Table 1 Composition of separating and stacking gels

电泳条件：采用恒压电泳，起始电压为80V，待样品进入分离胶后电压上升到120V至电泳结束，40℃染色30min再脱色。

2 结果与分析

2.1 鸡骨蛋白酶解过程中的氮存在形式变化

图1 鸡骨酶解过程中的氮存在形式Fig.1 Changes in amino nitrogen, soluble nitrogen and peptide nitrogen during the hydrolysis of chicken bone protein

由图1可知，风味酶酶解鸡骨过程中，氨基态氮与可溶性氮均随着酶解时间的延长不断增加，在初始的4h内增速最快。尽管氨基态氮和可溶性氮的含量在酶解过程中都不断增加，由于酶解过程中同时存在着蛋白降解成肽和氨基酸以及这些肽被进一步降解成更小分子质量的肽和氨基酸两个过程，这两个过程，优势过程对产物中肽的含量有直接的影响。风味蛋白酶酶解鸡骨过程中，氨基态氮在整个水解过程中一直增加，水解24h后最大氨基态氮值为30.23%；可溶性氮在前4h快速增加，达到72.2%， 24h后可溶性氮值达到最大值82.74%；而肽基氮在水解开始时快速增加，在4～8h间达到最大值，然后出现下降，随着水解的继续进行，肽基氮的含量逐渐减少。与肖如武等[12]研究马氏珍珠贝肉、赵谋明等[13]研究海产低值鱼的酶解规律类似。本实验选用的风味蛋白酶是利用米曲霉发酵提取而得，经过复配而成的复合酶，其包含了内切蛋白酶和外切肽酶的两种活性，在水解初始的4h，风味蛋白酶主要以鸡骨蛋白为酶解底物，释放多肽和氨基酸，随后肽含量的增幅变缓，8h后，溶液中的肽也成为风味酶的酶解底物，释放出更多的小肽和氨基酸。

2.2 酶解鸡骨蛋白过程中产物的呈味变化

酶解产物的呈味特性是蛋白酶解过程中不断生成游离氨基酸，包括鲜、甜、苦、酸、咸味氨基酸，小分子肽包括苦味肽、鲜味肽(或风味提升肽)和其他呈味肽，以及与水解液中的有机酸、糖类、盐等共同作用的结果[14]。水解产物的风味对其应用有着重要的影响，其中苦味最为关键，而鲜味则是水解动物蛋白应用于调味基料的一个重要参考指标。

图2 鸡骨酶解过程中的呈味评价Fig.2 Change in delicious taste and bitter taste values during the hydrolysis of chicken bone protein

由图2可知，风味蛋白酶酶解鸡骨蛋白的整个过程中，鲜味值都远大于苦味值，鲜味值随着酶解进行不断增强，苦味值随着酶解的深入逐渐达到稳定，但整个酶解液苦味都不明显。酶解产物中的鲜味主要来源于酶解过程中产生的鲜味、甜味氨基酸，而苦味则主要是酶解过程中产生的苦味肽。因为风味酶中含有大量的肽酶，能从肽的N-端或C-端裂解出疏水性氨基酸而使苦味肽的苦味减弱。之外作者还曾对比过不同蛋白酶酶解鸡骨过程中的呈味评价，发现鲜味值都随着酶解进行而增强，而苦味值的规律则因酶不同而有不同变化。

2.3 鸡骨蛋白酶解过程中游离氨基酸含量的变化

由表2可知，多数游离氨基酸的含量都随着酶解时间的延长而不断增加，酶解24h产物的游离氨基酸为401.45mg/100mL，是酶解4h产物游离氨基酸含量的2倍。酶解16h后，Ile、Phe、Arg、Pro等出现下降，这可能是由于酶解后期疏水氨基酸大量释放，多肽通过转肽作用将疏水性氨基酸生成不溶于水的疏水性肽类，浓缩成小颗粒形成不溶于水的类蛋白[15]，酶解鸡肉[14]、酶解花生粕[16]的过程中也发现了此现象。酶解4h，疏水氨基酸Phe、Lys、Leu、Arg 和亲水氨基酸Glu、 Gly、Ala含量较多，随着酶解进行，4～8h时Val、Met、Ile、Leu和Tyr的增长率加快，8～16h间各种氨基酸平稳增加，其中Asp与Ile增速较快，说明酶解后期，肽链上末端含Asp与Ile残基为风味酶水解位点之一。

表2 风味蛋白酶酶解鸡骨蛋白过程中游离氨基酸组成Table 2 Change in free amino acid composition during the hydrolysis of chicken bone protein mg/100mL

图3 酶解液中鲜、苦味氨基酸的含量变化Fig.3 Changes in the contents of umami and bitter amino acids during he hydrolysis of chicken bone protein

在风味蛋白酶酶解鸡骨蛋白过程中呈味氨基酸大量释放，由图3可知，鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸)和苦味氨基酸(苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸)的总量随着酶解进行不断增大，其中鲜味氨基酸的总量24h时为156.62mg/100mL，是4h时72.93mg/100mL的2.15倍，鲜味氨基酸占总氨基酸的含量在酶解4h时为35.82%，在24h时上升到39.01%；苦味氨基酸的总量在24h时为203.56mg/100mL，是4h时的105.16mg/100mL 的1.94倍，苦味氨基酸占总氨基酸的含量在8h时达到最大值54.13%，之后随着酶解进行逐渐降低。虽然鲜味氨基酸的含量一直比苦味氨基酸含量低，但从图2的呈味评价来看，风味酶酶解产物的鲜味评价远高于苦味评价，鲜味评价同鲜味氨基酸含量以及其占总氨基酸的比例基本一致，都随着酶解时间延长而增加，而苦味的评价同苦味氨基酸占总氨基酸的变化规律不完全一致，可能的原因是酶解产物的鲜味主要受酶解过程中鲜味氨基酸的影响，而苦味受苦味氨基酸影响较小，主要由蛋白酶解过程中苦味肽造成的。

2.4 鸡骨蛋白酶解过程中多肽分子质量分布

图4 鸡骨酶解过程中的多肽分子质量分布情况Fig.4 Tricine-SDS-PAGE electropherograms of chicken bone hydrolysates at different time points of hydrolysis

由图4可知，鸡骨酶解过程中，原料蛋白大量降解，生成大量多肽和氨基酸，分子质量在前4h迅速降低，酶解4h时，分子质量分布连续，在30.0～26.0kD之间有明显的多肽条带；酶解8h时，分子质量快速降低，多肽集中在20.0kD以下；酶解24h，鸡骨酶解产物的多肽几乎都在10.0kD以下。

3 结 论

3.1 风味蛋白酶酶解鸡骨蛋白过程中，氨基态氮和可溶性氮均随着酶解的深入逐渐增加，在前4h增速最快，肽基氮上升到最大值后出现下降。

3.2 酶解物的游离氨基酸含量随着酶解时间延长逐渐增多，在24h达到最大值，呈味氨基酸的含量和比例对产物的呈味评价有重要影响。3.3 酶解物的鲜味在酶解过程中逐渐增强，苦味逐渐达到稳定，由于所选酶为风味蛋白酶，苦味在整个酶解过程都不明显。3.4 通过对酶解液的电泳分析，显示鸡骨酶解过程中，肽的含量和分子质量都逐渐降低，酶解24h，鸡骨酶解产物的多肽几乎都在10.0kD以下。

[1] 徐德峰, 张卫明, 孙晓明, 等. 响应曲面法在鸡骨架蛋白酶解工艺中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2007, 33(4): 82-86.

[2] 丁小燕, 张雯, 陈延峰, 等. 复合风味蛋白酶水解鸡骨泥工艺条件的研究[J]. 中国食品学报, 2006, 6(1): 88-92.

[3] CHENG Fuyuan, LIU Yutse, WAN Tienchun, et al. The development of angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from chicken bone protein[J]. Animal Science Journal, 2008, 79: 122-128.

[4] 尹礼国, 徐洲, 于颖, 等. 鸡骨酶解物的制备与应用[J]. 中国调味品,2008(5): 88-92.

[5] 吴谋成. 食品分析与感官评定[M]. 北京: 中国农业出版社, 2004: 78-79.

[6] ZHAO Mouming, ZHOU Xuesong, LIN Weifeng. Changes of taste composition during the enzymatic hydrolysis of chicken meat[J]. Food Science, 2006, 27(5): 68-71.

[7] KIJIMA K, SUZUKI H. Improving the umami taste of soy sauce by the addition of bacterial γ-glutamyltranspeptidase as a glutaminase to the fermentation mixture[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41:80-84.

[8] SCHAGGER H, JAGOW G V. Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kD[J]. Anal Biochem, 1987, 166: 368-379.

[9] 曹佐武. 小分子肽的Tricine-SDS-PAGE分离方法[J]. 生物学通报,2003, 38(3): 55-56.

[10] 戴志远, 任明, 张燕平. 电泳和层析方法对梅鱼蛋白酶解产物的分离分析[J]. 中国食品学报, 2007, 7(4): 101-105.

[11] 孙波, 迟玉杰, 徐宁, 等. Tricine-SDS-PAGE 电泳检测蛋清肽分子量的研究[J]. 食品科学, 2008, 29(5): 385-388.

[12] 肖如武, 崔春, 赵谋明, 等. Pancreatin酶解马氏珍珠贝肉蛋白过程中产物性质研究[J]. 食品发酵与工业, 2008, 34(7): 41-46.

[13] 赵谋明, 崔春, 王金水. 海产低值鱼酶解过程中呈味物质变化趋势的研究[J]. 中国食品添加剂, 2007(G00): 281-285.

[14] 周雪松. 鸡肉蛋白酶解及其产物抗氧化活性研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2006.

[15] YAMASHITA M, ARAI S, TANIMOTO S, et al. Condensation reaction occurring during plastein formation by α-chymotrypsin[J]. Agric Biol Chem, 1973, 37: 953-954.

[16] 盖云霞. 花生粕脱毒、酶解及酶解过程中氨基酸释放规律的研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2007.

Nitrogen and Taste Changes in Chicken Bone Protein during Enzymatic Hydrolysis with Flavourzyme and Tricine-SDS-PAGE Analysis of Polypeptide Degradation

ZHANG Heng，WU Ying-long*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In this work, changes in nitrogen existing form, taste, free amino acid composition and the contents of delicious and bitter amino acids in chicken bone protein were investigated during enzymatic hydrolysis with Flavourzyme. The results indicated that both amino nitrogen and soluble nitrogen gradually increased with the extension of Flavourzyme-catalyzed hydrolysis, while peptide nitrogen first increased up to its maximum and then decreased. As the hydrolysis time was prolonged,the umami taste of chicken bone protein hydrolysate presented an increase, and the bitter taste gradually tended to be stale during later stages of the hydrolysis. The content of free amino acids reached its maximum level after 24 hours. Therefore, a large number of released tasty amino acids seem to be responsible for the flavor of chicken bone protein hydrolysate. Tricine-SDS-PAGE analysis showed that polypeptides were gradually degraded during the hydrolysis of chicken bone protein and that all peptide molecules in the 24 h hydrolysate had a molecular weight of less than 10.0 kD.

chicken bone protein；enzymatic hydrolysis；taste characteristics；amino acid；Tricine-SDS-PAGE

TS201.21

A

1002-6630(2011)05-0111-04

2010-05-26

国家星火计划项目(2008GA810026)

张恒(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品。E-mail：57296494@qq.com

*通信作者：邬应龙(1963—)，男，教授，博士，研究方向为功能性食品。E-mail：wuyinglong99@163.com