陈贵堂，赵立艳，赵 霖，綦国红，李 博，王岁楼

(1.中国药科大学药学院，江苏 南京 210009；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；3.中国人民解放军总医院营养科，北京 100853)

花生肽对半乳糖致大鼠肝损伤的抑制作用

陈贵堂1，赵立艳2，赵 霖3，綦国红1，李 博1，王岁楼1

(1.中国药科大学药学院，江苏 南京 210009；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；3.中国人民解放军总医院营养科，北京 100853)

为研究花生肽对D-半乳糖诱导的大鼠化学性肝损伤的保护作用，将50只SD大鼠随机分为5组(对照组、模型组、低中高剂量花生肽组)，除对照组外，其余各组大鼠按其体质量每天皮下注射D-半乳糖400mg/kg建立氧化损伤模型，同时3个花生肽组每天分别按200、500、800mg/kg的剂量灌胃，持续50d。检测血清生化指标以及肝脏中脂褐素含量和抗氧化酶活力，并进行肝组织病理学镜检。结果表明，花生肽能明显对抗氧化损伤大鼠血清中总胆汁酸的积累，抑制谷丙转氨酶和碱性磷酸酶活力的升高，提高肝脏中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活力，并能够降低大鼠肝脏中的脂褐素含量，有效减轻大鼠肝脏的组织病理形态学变化。表明花生肽对D-半乳糖诱导的大鼠肝损伤有一定的保护作用。

花生肽；肝损伤；D-半乳糖；保肝

近十几年来，源于食物蛋白质酶解产物中的生物活性肽引起了国内外学者的高度关注，特别是具有延缓衰老作用的抗氧化肽已成为当前生物活性肽领域引人注目的研究方向之一，如鱼蛋白多肽[1-2]、卵蛋白多肽[3]、乳蛋白多肽[4-5]、大豆多肽[6-7]以及花生多肽[8-10]等。近几年，又有多项研究表明，这些抗氧化肽对半乳糖胺[11-12]、四氯化碳[13]及酒精[14-15]引起的小鼠急性肝损伤都具有一定的保护作用，并提示这些功能的实现可能主要依赖于其抗氧化活性。笔者也曾采用多种实验方法评价了Alcalase酶解所得花生肽的抗氧化活性，结果表明花生肽无论在体外还是在动物体内都具有很强的抗氧化能力[8-9]。为进一步研究花生肽在体内的生理活性，本实验采用D-半乳糖诱导的氧化损伤大鼠模型，通过灌胃给予模型大鼠不同剂量的花生肽，考察花生肽对D-半乳糖所致的大鼠亚急性肝损伤的保护作用，为花生抗氧化肽乃至花生饼粕蛋白的进一步开发应用提供实验依据，也有望为人们提供一种安全的保肝功能性食品，这对于肝炎病高发的国家来说，无疑是具有重要意义的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生蛋白 市售；蛋白酶Alcalase2.4L 丹麦Novo公司；D-半乳糖(分析纯) 中国医药集团上海化学试剂公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；甲醛(优级纯) 北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

中空纤维滤膜器 天津膜天膜工程技术有限公司；全塑动物代谢笼 自制；Hitachi7600全自动生化分析仪日本Hitachi公司；101-3E电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司；Lambda7紫外-可见分光光度计、Ls-5荧光光度计 美国P.E公司；Sartorius电子天平 德国哥廷根赛多利斯股份有限公司；LDZ5-2自动平衡离心机 北京医用离心机厂；Model Bx51TF光镜 日本Olympus Optical公司。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，50只，体质量195～205g，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 花生肽的制备

以花生分离蛋白为原料，采用Alcalase2.4L 蛋白酶酶解，酶解条件为：pH7.5，温度55℃，底物质量浓度为8g/100mL，酶添加量为3%，在酶解过程中不断加入1.0mol/L NaOH溶液使pH值保持恒定，水解时间为6h。酶解完毕后沸水浴3min使酶失活，立即冷却，3000r/min离心10min，经10kD中空纤维滤膜超滤，滤液浓缩后真空干燥即得花生肽。经测定，该花生肽总氮含量达14.6%，其分子质量基本在300～2600D范围内，其中分子质量在1000D以下的约占98.5%。

1.4.2 动物分组及饲养

将大鼠根据体质量随机分为5组，即对照组，D-半乳糖模型组，低、中、高剂量花生肽组，每组10只。除对照组外，其余各组大鼠按其体质量每天皮下注射D-半乳糖400mg/kg，持续50d，对照组大鼠则每天皮下注射等量生理盐水，花生肽低、中、高剂量组每天分别按200、500、800mg/kg的剂量灌胃，对照组及模型组用等量蒸馏水灌胃，每天称其质量1次。于空调动物实验室内，在全塑代谢笼内单独饲养，采用对喂法，保证实验周期内每只大鼠食物平均摄入量相等，自由饮用蒸馏水。环境参数为：温度(23±1)℃，相对湿度(60±5)%，12h昼夜交替。

1.4.3 样品收集

在第50天禁食12h后，大鼠断头取血，3000r/min离心15min分离出血清，用于生化指标的测定。解剖大鼠，迅速取出肝脏，生理盐水冲洗干净，用滤纸吸去水分，一部分用于脏器组织形态学观察，一部分用预冷的生理盐水制成10g/100mL匀浆，3000r/min低温离心10min，取上清液进行SOD、GSH-Px和CAT活力以及脂褐素(LF)含量测定。

1.4.4 检测指标

1.4.4.1 血清生化指标测定

在分离出血清样品24h内用全自动生化分析仪检测。检测项目包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、总胆汁酸(TBA)、肌酐(Cr)含量和谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)以及碱性磷酸酶(ALP)活力。

1.4.4.2 肝组织中SOD、GSH-Px和CAT活力的测定

SOD活力采用黄嘌呤氧化酶法进行测定，按测定试剂盒操作规程进行，以每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)；GSH-Px活力采用DTNB法测定，按试剂盒操作规程进行。以每毫克组织蛋白在37℃反应5min，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个活力单位(U)；CAT活力采用钼酸铵法测定，取0.05mL经生理盐水稀释的1g/100mL组织匀浆，按测试盒操作程序加入试剂，用0.5cm光径比色杯测定其在405nm波长处的吸光度，根据公式计算CAT活力，以每毫升血清或每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmol的H2O2为一个活力单位(U)。

肝组织中蛋白质含量采用福林-酚法测定，以小牛血清白蛋白为标准。

1.4.4.3 肝组织中LF含量测定

参照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003)规定方法略加修改进行测定。取肝组织约200mg左右，加入定量蒸馏水用匀浆器制成5g/100mL的组织匀浆，然后加入4.0mL于50℃预热的氯仿-甲醇混合液(体积比2:1)，用旋涡振荡器充分混匀，3000r/min离心10min，此时样品分为3层，上层为水相，中层为组织沉淀相，下层为氯仿-甲醇相。小心吸去上层水相，用带长麻醉针头的注射器沿试管壁穿过中层，将下层氯仿甲醇提取液吸出。然后再向提取液中加入甲醇0.2mL，轻轻振荡混匀，使之清澈透明，置紫外灯下照射30s，倒入石英比色杯中，以0.1μg/mL的硫酸奎宁为标准对照，氯仿-甲醇混合液为空白，在狭缝4.4，灵敏度3.6，激发波长360nm，发射波长450nm(在此条件下，标准品的荧光强度为55～60)，测定样品的荧光强度。肝组织中LF含量按下式计算。

式中：F0为样品荧光强度；F1为空白荧光强度；F2为硫酸奎宁荧光强度；ρ为硫酸奎宁质量浓度(0.1μg/mL)；V为匀浆体积/mL；m为样品质量/g。

1.4.4.4 脏器组织形态学观察

取大鼠肝脏，常规病理取材、福尔马林固定、梯度浓度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片、烤片、苏木精-伊红染色、脱水、透明、封片，光镜下进行病理形态学观察。

1.5 统计分析

2 结果与分析

2.1 大鼠的生长状况

表1 花生肽对大鼠体质量的影响(n=10)Table 1 Effect of peanut peptide on body weight of rats (n=10)

在整个饲养期间，所有大鼠食欲良好，生长状态正常，其体质量变化如表1所示。各组大鼠初始平均体质量基本相同，组间无显著差异(P＞0.05)，给予不同的处理后，各组大鼠生长速度各不相同，其中对照组体质量增加最快，模型组体质量增加最慢，至第3周时二者体质量达显著差异。经口服花生肽后，大鼠生长速度随着多肽浓度的增加而增加，其中中、高剂量组大鼠体质量增长速度在前4周基本与对照组平行，第5、6周有所减缓，第7周又开始加快，至第7周末其体质量与对照组无明显差异，而显著高于模型组(P＜0.05)。

2.2 血清生化指标

表2 大鼠血清生化指标测定结果(n=10)Table 2 Effect of peanut peptide on serum biochemical indexes in rats(n=10)

从表2可以看出，TP、ALB、TC、Cr含量以及AST、ACP活力在各组之间均无显著差异(P＞0.05)。与对照组相比，D-半乳糖致氧化损伤组大鼠血清TBA含量以及ALP、ALT活力显著增高，而LDH活力显著下降(P＜0.05)；与模型组相比，3个花生肽组，尤其是中、高剂量花生肽明显抑制了TBA含量和ALP、ALT活力的升高(P＜0.05)，但对LDH活力影响不大(P＞0.05)。

2.3 肝脏SOD、GSH-Px、CAT活力和LF含量

表3 花生肽对大鼠肝脏中SOD、GSH-Px、CAT活力及LF含量的影响(n=10)Table 3 Effect of peanut peptide on liver SOD, GSH-Px, CAT levels and LF contents in rats (n=10)

从表3可以看出，与对照组相比，模型组以及中、低剂量花生肽组大鼠肝脏SOD、GSH-Px和CAT活力均显著下降(P＜0.05)，模型组和低剂量花生肽组肝脏LF含量极显著增加(P＜0.01)。而与模型对照组相比，只有高剂量组大鼠肝脏SOD、GSH-Px和CAT活力显著升高(P＜0.05)，而中、高剂量两个花生肽组LF含量均显著下降(P＜0.05)。

2.4 大鼠肝脏的组织形态学观察

图1 大鼠肝组织的形态学比较 (×260)Fig.1 Histological change of liver tissues in rats (×260)

通过镜检肝组织切片可以观察到，对照组小鼠肝细胞索排列整齐，肝窦正常，肝小叶结构与胞核结构均较清晰(图1a)。与对照组相比，模型组大鼠肝小叶结构虽未见紊乱，但肝窦枯否细胞增生，汇管区小胆管增生，肝细胞胞浆内出现多数小的脂质空泡，部分肝细胞核固缩，胞浆红染(图1b)。低剂量花生肽组大鼠肝细胞胞浆内脂质空泡有所减少，但核固缩细胞还是较多(图1c)；中剂量花生肽组大鼠肝细胞胞浆内脂质空泡明显减少，核固缩细胞也有所减少(图1d)；高剂量花生肽组大鼠肝细胞胞浆内脂质空泡明显减少，核固缩细胞及胞浆红染也明显减少，肝窦枯否细胞无明显增生，基本接近对照组(图1e)，组织病理学变化呈现出了良好的剂量-效应关系。

3 讨 论

3.1 花生肽对大鼠体质量以及肝功能的影响

多数研究表明，实验动物给予过量半乳糖后，生长迟缓，体质量减轻[16]，本实验也得到了同样的结果，但花生肽的补充有效地抵抗了大鼠体质量的下降。

血清总胆汁酸(TBA)是胆固醇在肝脏分解的代谢产物，由肝脏分泌到胆汁，用于脂肪的消化和吸收，因此与肝脏关系十分密切，当肝脏一旦发生实质性损伤，肝细胞发生病变时，血清中TBA含量明显升高。由表2可知，模型组大鼠血清TBA比对照组升高了1.2倍，说明D-半乳糖确实造成了大鼠的肝损伤，中、高剂量花生肽组大鼠血清TBA含量虽然显著高于对照组，但却明显低于模型组，说明花生肽可在一定程度上减缓肝损伤。

血清谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)活力均可为肝细胞损伤和坏死的标志之一，它们活力的大小直接反映了肝细胞受损的程度。本实验表明，半乳糖致氧化损伤大鼠血清ALT显著高于对照组，进一步显示了半乳糖对肝脏细胞的损伤作用。3个剂量的花生肽均能明显对抗半乳糖致氧化损伤大鼠血清ALT的升高，表明花生肽确实能有效干预半乳糖所致肝细胞损伤，改善肝功能。

碱性磷酸酶(ALP)几乎存在于机体的各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏、肾脏含量较多。ALP经肝胆系统进行排泄，所以当ALP产生过多或排泄受阻时，均可使血中ALP发生变化。当机体患有肝胆疾病，如阻塞性黄疸时，由于胆汁排泄不畅，会使ALP滞留于血中而增高，另外急慢性黄疸型肝炎或肝癌时也可使ALP升高。本实验中，D-半乳糖致氧化损伤大鼠血清ALP活力显著升高，表明其肝功能可能受损，而补充中、高剂量花生肽后有效抵制了血清ALP活力的上升，使其恢复到正常水平，再次显示了花生肽保护肝功能的作用。

乳酸脱氢酶(LDH)在所有组织中普遍存在，尤以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。这些组织中的LDH活力比血清中高得多。所以当少量组织坏死时，该酶即释放入血而使血液中LDH的活力升高。测定此酶常用于对心梗、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。但本实验结果显示，D-半乳糖致氧化损伤大鼠血清LDH活力显著下降，补充花生肽后对LDH的活力没有明显影响，而关于LDH活力下降的临床意义目前未见报道，所以其原因尚无法解释。

3.2 大鼠肝组织中LF含量和抗氧化酶活力的变化

机体产生的氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，形成丙二醛(MDA)等脂质过氧化物和新的氧自由基。MDA是脂褐素形成过程的中间产物，它能间接反映机体内的脂质过氧化水平。大量实验证明，氧化损伤时MDA水平或LF含量显著升高。本项研究观察了D-半乳糖诱发氧化损伤对大鼠肝组织脂褐素含量的影响，发现D-半乳糖可以诱发模型动物脂褐素沉积明显增加。而补充高剂量花生肽(800mg/kg)后，可显著降低肝脏LF含量，提示花生肽作为外源性的抗氧化物质，能够促进机体产生内源性抗氧化物质，清除自由基，抑制脂质过氧化损伤。

SOD、GSH-Px和CAT是体内重要的酶抗氧化系统，SOD能使超氧自由基歧化为氧气和过氧化氢，CAT可使过氧化氢分解成为水和氧气，GSH-Px可催化还原型的谷胱甘肽转变为氧化型的谷胱甘肽，从而消除细胞中的有机或无机的过氧化物。本实验结果表明，D-半乳糖致氧化损伤模型大鼠肝组织中SOD和GSH-Px和CAT活力均显著降低，而3个剂量花生肽组能不同程度抑制肝组织中这些抗氧化酶活力的下降，其量效关系均呈正相关，提示花生肽具有清除氧自由基、活性氧及抗脂质过氧化作用，因此可能对与自由基有关的疾病有防治作用。

3.3 大鼠组织的形态学变化

肝脏的形态学老化改变表现为肝实质细胞数减少，肝再生功能减退；肝小叶容积变小，门管区纤维增加，肝动脉壁的纤维增厚；组织学肝细胞核的多倍性增加，肝脏出现巨大实质细胞[17]。本研究结果显示，D-半乳糖致氧化损伤大鼠的肝实质细胞数虽未见明显减少，但出现肝窦枯否细胞增生、汇管区小胆管增生、肝细胞胞浆内出现多数小的脂质空泡以及部分肝细胞核固缩和胞浆红染等组织学特征，这可能与半乳糖的代谢产物在肝脏的损伤作用有关。低剂量花生肽组大鼠肝细胞胞浆内脂质空泡有所减少，但核固缩细胞还是较多；中剂量花生肽组大鼠肝细胞胞浆内脂质空泡明显减少，核固缩细胞也有所减少；高剂量花生肽组大鼠肝细胞胞浆内脂质空泡和核固缩细胞及胞浆红染均明显减少，肝窦枯否细胞无明显增生，表明花生肽对半乳糖所致肝损伤有一定的防护作用，这也与上述花生肽抑制大鼠血清TBA的积累以及抑制ALT和ALP活力增高的结果相符合。

综上所述，花生肽具有较强的抗氧化能力，并能有效地干预D-半乳糖所致大鼠的亚急性肝细胞损伤，但其保肝的药理学作用机制还有待深入研究。

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Hepatoprotective Effect of Peanut Peptide in D-Galactose-induced Liver Damage in Rats

CHEN Gui-tang1，ZHAO Li-yan2，ZHAO Lin3，QI Guo-hong1，LI Bo1，WANG Sui-lou1
(1. School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；3. Nutrition Department, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

In order to explore the hepatoprotective effect of peanut peptide (PP) on D-galactose (D-Gal)-induced liver damage in rats, fifty rats were randomly divided into five groups designated as control group, model group and three PP-treated groups.Except for the control group, the other groups were subcutaneously injected with D-Gal solution at a daily dosage of 400 mg/kg for 50 successive days to establish oxidative damage model. Meanwhile, rats in PP treatment groups were orally administered with PP at dosages of 200, 500 mg/kg and 800 mg/kg, respectively. The biochemical index, lipofuscin (LF) content, and superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) activities in liver were analyzed. In addition,histopathological characters in liver tissues were observed under a light microscope. The results showed that a D-Gal-induced rat model with liver damage was successfully established. PP significantly decreased the levels of TBA, ALT and ALP in serum and LF in liver, and obviously increased the levels of SOD, GSH-Px and CAT in liver in a dose-dependent manner. Furthermore, the histopathological characters of liver tissues in PP treatment group at high dosage were close to those in the control group.Therefore, PP has an excellent protective capability against liver damage in D-Gal-induced rats.

peanut peptide；liver damage；D-galactose；hepatoprotective effect

TQ936.16

A

1002-6630(2011)05-0296-05

2010-06-29

陈贵堂(1977—)，男，副教授，博士，研究方向为食品营养化学与功能食品学。E-mail：caucgt@163.com