张晓玲，惠芸华，杨 桥*

(中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部水产品质量监督检验测试中心，上海 200090)

微生物发酵产大豆异黄酮苷元的连续超声波提取工艺及其定量分析研究

张晓玲，惠芸华，杨 桥*

(中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部水产品质量监督检验测试中心，上海 200090)

选取浅玫瑰链霉菌、红色糖多孢菌及黑曲霉为发酵菌种，采用Plackett-Burman设计及正交试验，对影响微生物发酵法产大豆异黄酮苷元(染料木黄酮、黄豆苷元、黄豆黄素)的连续超声波提取工艺的主要试验因素进行系统优化。以浅玫瑰链霉菌为发酵菌种的实验结果表明：各主要试验因素对3种异黄酮苷元提取率影响程度大小为：抽提溶剂组分、超声波时间、淋洗液体积。而温度、溶剂流速两个因素与提取效率负相关。连续超声波作用时间及抽提溶剂组分为影响异黄酮苷元提取工艺的两个主要影响因素。当两因素的最优值分别为7min及70%时，总异黄酮苷元提取率为(98.7±1.23)%。通过固相萃取(SPE)可有效去除发酵提取液中杂质对HPLC定量分析的干扰，并使3种异黄酮苷元含量浓缩10倍以上，从而使HPLC方法的检测限达到10-3μg/mL，样品总分析时间小于10min，样品回收率为96.2%～103.4%，RSD值小于2.34%。上述结果表明，该方法可满足微生物发酵法产大豆异黄酮苷元的高效提取纯化及快速定量分析。

大豆异黄酮苷元；连续超声波提取；固相萃取；微生物发酵

大豆异黄酮(isoflavones)具有弱雌激素活性、抗氧化、抗衰老，预防癌症、老年痴呆症及心血管疾病、改善骨质疏松及妇女更年期综合症等多重功效，已在食品、保健品、医药等行业得到广泛应用[1-4]。而游离型苷元(aglycon)是大豆异黄酮中生物活性及人体生物利用度最高、疾病预防及治疗功效的最有效形式(图1)。目前，豆科植物仍是提取大豆异黄酮的主要材料来源。但其中的苷元异黄酮含量低(仅占总含量的1%～2%)，不能满足当前日益增长的巨大市场需求[5]。与化学合成法及提取法相比，通过微生物发酵法生产苷元异黄酮，可显著降低生产成本、大幅度提高产量的同时，实现苷元异黄酮的直接生产[5-6]，并可通过高产菌株的选育及发酵调控技术进一步提高产量，并可通过基因工程实现苷元异黄酮的异源高表达。上述优点使微生物发酵法展现出了广阔的工业应用前景[6-8]。

目前，发酵产异黄酮苷元的微生物菌株主要包括：浅玫瑰链霉菌、红色糖多孢菌、黑曲霉、根霉、乳酸杆菌等[5-11]，而目前国内外鲜有微生物发酵法产异黄酮苷元高效快速提取及定量分析方面的报道。本实验优化了异黄酮苷元的连续超声波提取工艺条件，并应用于3种常用的异黄酮苷元产生菌株发酵，使用固相萃取技术(solid phase extraction，SPE)，在高效富集目的产物的同时，有效消除了微生物发酵提取液中杂质对异黄酮苷元HPLC定量分析的干扰。该方法准确、高效且易于实现自动化。可为异黄酮苷元工业化微生物发酵生产的高效提取及分析提供有益参考。

图1 3种大豆异黄酮苷元的化学结构示意图Fig.1 Chemical structures of three isoflavone aglycones

表1 异黄酮苷元标准品的分子式及相对分子质量Table 1 Formula and relative molecular weights of three isoflavone aglycones

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

异黄酮苷元标准品：染料木黄酮(genistein，Ge)、黄豆苷元(daidzein，D)及黄豆黄素(glycitein，G)(纯度＞99%) 美国Sigma公司。

乙腈、乙醇(色谱纯) 美国Fisher公司；醋酸(分析纯) 国药集团(上海)化学试剂公司；纯水由美国Milli-Q纯化系统制备；ODS RP-C18固相萃取(SPE)小柱(100mm×1.0mm) 美国Alltech公司。

1.2 微生物菌株及培养基

异黄酮苷元微生物发酵菌株：浅玫瑰链霉菌(Streptomyces roseolus ATCC 31047)及红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635)均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，黑曲霉(Asperillus niger NRRL-3122)购自美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)。

发酵培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)购自美国Difco公司，其他培养基购自英国Oxide公司。

1.3 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪购于美国Agilent公司，配置以下组件：高压四元梯度泵、真空在线脱气机、定量进样六通阀(20μL)、二极管阵列紫外-可见检测器(DAD)。由工作站ChemStation软件(Version 10.0.2)控制各组件的运行及进行数据分析。

1.4 方法

1.4.1 菌株培养与发酵

浅玫瑰链霉菌(ATCC 31047)的固态发酵培养参照文献[12]进行。黑曲霉(NRRL-3122)的固态发酵培养参照文献[10,13]进行。红色糖多孢菌(ATCC 11635)的摇瓶发酵培养参照文献[14]进行。

1.4.2 连续超声波提取及SPE除杂浓缩

取适量发酵基质或发酵液，置于超声波提取腔内。按体积比1:5或固液比1:6(m/V)加入70%乙醇溶液，关闭工作回路后开启超声波系统。参数设定如下：超声波功率：500W，提取溶剂循环速度：5.0mL/min，提取时间7min，温度50℃，超声波探针顶端距提取溶剂液面1.0mm。溶剂流向每8s改变一次。

超声波探针连续提取完成后，由PPP蠕动泵驱动，吸取500μL提取物，经0.45μm过滤器过滤后，以4.0mL/min 速度注入SPE小柱(柱径1.0mm)内后，加入100μL 75%乙醇溶液进行洗提，淋洗液使用1.5mL EP管收集。取20μL进样进行HPLC分析。

1.4.3 标准曲线的构建

准确称取各标准品5.0mg，用10mL甲醇溶解后转移到50mL容量瓶中，加水定容至50mL，即得到0.1mg/mL标准溶液。分别准确吸取该标准液使用甲醇进行稀释，配制不同浓度的标准工作溶液。以空白溶剂作对照。取20μL进样，进行HPLC定量分析。以峰面积(y)及异黄酮苷元浓度(x)进行线性回归分析。染料木黄酮(Ge)：y＝18524x＋22356.2(R2＝0.9996)，线性范围为0.17～2.38μg/mL；黄豆苷元(D)：y＝33254x＋42558.4(R2＝0.9998)，线性范围为0.14～1.58μg/mL；黄豆黄素(G)：y＝38544x＋33251.8(R2= 0.9995)，线性范围为0.11～3.56μg/mL。

1.4.4 HPLC定量分析条件

美国Agilent 1100高效液相色谱仪。色谱柱：Agilent XDB ODS RP-C18(250mm×4.6mm，5μm)分析柱；流动相A：水；流动相B：含0.05%醋酸的乙腈；洗脱梯度：0～10min：流动相B体积分数从10%上升到50%；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：254nm。进样量：20μL。使用Agilent ChemStation 3D色谱工作站(Version 10.0.07)进行仪器控制和数据分析。HPLC定量分析根据标准品保留时间(tm)及DAD检测器收集的被分析物质的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱数据确定样品中的组分，以峰面积定量。以回收率计算总异黄酮苷元的提取率。

1.5 实验设计及数据分析

实验设计、数据分析及模型建立均使用Design-Expert 7.0软件完成。

2 结果与分析

以浅玫瑰链霉菌为发酵菌种，对其发酵产大豆异黄酮苷元的连续超声波提取工艺进行系统研究。

2.1 确定样品除杂及色谱分析条件

图2 微生物发酵提取物的HPLC检测图谱(254nm)Fig.2 Representative HPLC chromatograms of genistein, daidzein and glycitein in ethanol extract with and without SPE pretreatment (254nm)

微生物发酵液中含有多种杂质，干扰HPLC对目的分析物质的色谱分离及定量分析。因此，要实现目的分析物质的快速分析，必须对发酵提取液进行除杂处理，同时对影响HPLC分离条件的因素进行优化。首先对影响SPE及HPLC诸因素进行系统优化。结果表明，固定色谱分析柱类型，在乙腈中加入体积分数0.05%乙酸调节流动相的pH值后进行梯度洗脱，发酵提取物样品在10min内即可达到基线分离且峰形较好。样品前处理中使用ODS RP-C18SPE小柱可有效去除大多数干扰物质，且对染料木黄酮、黄豆苷元及黄豆黄素的浓缩倍数分别为13.7倍、11.5倍及10.8倍(图2)。使HPLC方法的检测限达到10-3μg/mL水平。样品回收率为96.2%～103.4%，RSD值小于2.34%。

2.2 通过Plackett-Burman(PB)设计筛选显著影响因素

根据预实验结果，影响连续超声波提取主要因素有5个，分别为抽提溶剂组分、抽提溶剂流速、连续超声波时间、温度、淋洗液体积。5个变量的高低取值及优化值见表2。本实验采用五因素三水平正交试验PB设计，研究上述5个因素对总异黄酮苷元提取率的影响。根据其统计结果，生成标准Pareto表(图3)。各因素对3种异黄酮苷元提取效率的影响程度由大到小顺序为：抽提溶剂体积分数、超声波时间、淋洗液体积。而温度、溶剂流速两个因素与提取率负相关。5个试验因素水平中，超声波作用时间及抽提溶剂体积分数两个因素超过统计学显著性的95%，为统计学显著变量。

表2 Plackett-Burman设计的各因素Table 2 Factor and levels of Plackett-Burman design

图3 PB设计中影响连续超声波提取各因素的标准Pareto表Fig.3 Standard Pareto chart for Plackett-Burman design

2.3 通过最佳爬坡试验接近重要因子的最优水平

根据2.2节结果，以连续超声波作用时间及抽提溶剂体积分数为重要因素设计最佳爬坡试验，试验设计及结果如表3所示。根据试验因素初筛结果，超声波提取时间及提取溶剂体积分数对于总异黄酮苷元提取率均呈正向作用，即提取率的高低随超声波作用时间及抽提溶剂体积分数的增高而提高。从表3可以看出，第4组试验的总异黄酮苷元提取率最高，其后提取率呈下降趋势，表示最优点在第4组附近。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Scheme and results of steepest ascent design

2.4 应用Box-Bohnken中心组合试验确定重要因素的最优水平

表4 中心组合设计试验及结果Table 4 Scheme and results of central composite design

以最佳爬坡试验的最优组第4组为中心，采用二次回归中心组合设计，进一步考察连续超声波作用时间及抽提溶剂体积分数两个因素对总异黄酮苷元提取率的响应。试验设计及结果如表4所示。

利用Design- Expert 6.0软件对Plackett Burman试验结果进行分析，拟合的二次方程模型为：Y=12.22－1.83X1－0.98X2＋ 2.34X1X2－1.236X12－1.098X22。回归模型使用F检验结果见表5。回归方程系数显著性检验结果见表6。由二次方程方差分析得F=32.68，决定系数R2值为0.9678，R2Adj值为0.9925。说明该模型在α＝0.01水平上具有显著性，且96.78%的总异黄酮苷元回收率可使用此模型解释。且实测值和预测值之间也具有很好的相关性。

表5 二次多项式回归方程模型变量分析表Table 5 Variance analysis for the developed quadratic polynomial regression model

表6 回归方程系数显著性检验表Table 6 Partial regression coefficients of the developed regression model and their significance

2.5 模型的验证

为确定所建立的实验模型与实际结果的相符性，通过进一步实验对模型可靠性进行了验证。对拟合的二次方程求导得到该模型的极值点，即连续超声波作用时间为7.2min，抽提溶剂为72.3%乙醇溶液时，预测的最高总异黄酮苷元提取率为98.1%。为实验方便起见，在验证实验中取连续超声波作用时间为7min，抽提溶剂为70%乙醇溶液。使用该组优化值进行3次平行重复实验，得到总异黄酮苷元平均提取率为(98.7±1.23)%。该值与预测值98.1%之间呈现良好拟合性，证实了该模型的有效性。

把该方法应用于红色糖多孢菌及黑曲霉发酵产大豆异黄酮苷元的提取及定量分析中。结果表明，对于红色糖多孢菌及黑曲霉，拟合的二次方程模型分别为：Y=4.34－2.66X1－1.13X2＋3.22X1X2－2.124X12－0.7787X22和Y = 4.87＋2.12X1－2.45X2－0.23X1X2－1.652X12－1.0981X22。根据试验模型所得总异黄酮苷元提取率的预测值分别为95.3%及98.7%。选取同样的超声波时间及抽提溶剂组分条件，进行3次平行重复实验，得其总异黄酮苷元提取率分别为(96.3±2.32)%和(98.7±2.17)%，与各自预测值之间均呈现良好拟合性。本方法为利用微生物发酵产异黄酮苷元的高效提取及分析提供了一个较适宜的实验模型。

3 结 论

连续超声波作用时间及抽提溶剂体积分数为影响微生物发酵产异黄酮苷元连续超声波提取工艺的两个主要影响因素。两因素的优化值分别为7min及70%乙醇溶液时，实验所得的总异黄酮苷元提取率为(98.7±1.23)%。

在样品前处理过程中使用固相萃取SPE小柱，可有效去除发酵提取液中杂质对异黄酮苷元HPLC定量分析干扰，并使3种异黄酮苷元含量浓缩10倍以上。

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Continuous Ultrasonic Extraction and Quantitative Analysis of Isoflavone Aglycones Produced by Microbial Fermentation

ZHANG Xiao-ling，HUI Yun-hua，YANG Qiao*
(Supervision and Test Center for Aquatic Products of Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China)

The aim of the present study was to optimize the continuous ultrasonic extraction process for isoflavone aglycones including genistein, daidzein and glycitein produced by Streptomyces roseolus (ATCC 31047) based on Plackett-Burman design and orthogonal array design. Results indicated that the order of three positive factors affecting extraction efficiency from strong to weak was solvent composition (ethanol aqueous solution), ultrasonic treatment time and eluent volume. However,extraction temperature and eluent flow rate exhibited a negative impact on extraction efficiency. Ultrasonic treatment time of 7 min and solvent composition of 70% ethanol concentration were found optimal, and the extraction rate of total isoflavone aglycones reached up to (98.7 ± 1.23)% under the optimal conditions. The application of solid-phase extraction (SPE) could effectively reduce the interference of impurity substances during the quantitative analysis of the above three isoflavone aglycones so that the detection limit of the developed SPE-HPLC method could reach 10-3μg/mL. The detection procedure was less than 10 min and the recovery rate was between 96.2% and 103.4% with a RSD of less than 2.34%. Therefore, this method can meet the requirements for high-efficiency extraction and rapid quantitative analysis of isoflavone aglycones produced by microbial fermentation.

isoflavone aglycones；continuous ultrasonic extraction；solid-phase extraction；microbial fermentation

TS201.2

A

1002-6630(2011)05-0239-05

2010-09-25

中央公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(2008M17)；上海市自然科学基金项目(11ZR1450000)

张晓玲(1978—)，女，助理研究员，博士，主要从事食品安全控制研究。E-mail：nyyqxl@126.com

*通信作者：杨桥(1979—)，男，副研究员，博士，主要从事微生物天然产物与药物研究。E-mail：qyang@mail.whu.edu.cn