陈 娜，生吉萍，申 琳*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

碱性芽孢杆菌木聚糖酶基因的克隆及表达

陈 娜，生吉萍，申 琳*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

本实验从广西红树林土壤中筛选出一株产木聚糖酶的耐碱菌HSL38，经过16S rDNA鉴定，其与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性达到99%。参考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA设计引物，扩增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10，其与xynA的同源性达到99%，编码396个氨基酸残基(45.27kD)，属于糖基水解酶GH10家族。将xyl-BH-G10基因与表达载体pET-30a-c(+)连接，构建重组载体，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明，在最佳诱导条件下，木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大肠杆菌细胞内高效表达，酶活力达到55.28U/mL，是原菌株HSL38发酵液酶活力的4倍。

碱性芽孢杆菌；木聚糖酶；克隆；表达

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，其最终的降解产物是自然界中重要的可再生资源[1]。木聚糖酶是一组可降解木聚糖的水解酶系，主要有β-1,4-木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酶，其中β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是木聚糖酶解过程中的关键酶[2-4]。木聚糖酶在自然界中分布广泛，存在于各种真菌、放线菌、细菌、植物、动物瘤胃等环境中，因此不同的木聚糖酶，氨基酸组成差异较大，根据酶催化区域的保守性，木聚糖酶主要归属于糖基水解酶GH10族和GH11族，高分子质量酶(大于30kD)多属于GH10族，低分子质量酶多属于GH11族[5]。通过分析酶的蛋白结构发现，木聚糖酶由催化区和非催化区组成，其中非催化区包括纤维素结合区、木聚糖结合区、热稳定区等，决定酶的温度和pH值稳定性以及底物的专一性[1]。

微生物对木聚糖酶的分泌具有可诱导性，在富含纯木聚糖或木聚糖残渣的培养基中，一些微生物的产酶量会增加，通常在木糖诱导下会促进产酶，在葡萄糖诱导下却抑制产酶[6]。在工业生产中，木聚糖酶可配合其他水解酶使用，降解植物半纤维素组织，获得低聚木糖及其下游分解产物资源。因此被广泛应用于食品加工、饲料生产、制浆造纸、能源工业等行业，具有很大的经济价值和应用前景[7]。碱性木聚糖酶可用于纸浆漂白工艺，减少环境污染，越来越受到人们的关注，具有广阔的应用前景[8]。本研究从碱性环境中筛选得到耐碱性强的具有木聚糖酶活性的芽孢杆菌，扩增获得木聚糖酶基因全序列，并实现了在大肠杆菌中的表达。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤样品：广西红树林土壤。

限制性内切酶、蛋白质分子质量标准 大连宝生物工程有限公司；Easypfu DNA聚合酶、DNA Marker、T4 DNA连接酶、质粒小量提取试剂盒、细菌总DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；卡那霉素 北京全新拓达公司；桦木木聚糖、SDS、Tris-Base、EDTA、IPTG 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 菌株、质粒及培养基

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、pEASYBlunt-Simple载体 北京全式金生物技术有限公司；pET-30a-c(+)载体 本实验室保存。

LB培养基(1L)：10g胰蛋白胨、5g酵母膏、10g NaCl，pH7.0。固体培养基加入1.5%～2.0%琼脂粉。碱性培养基(1L)：NaCl 20.0g、KH2PO42.0g、MgSO4·7H2O 1.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖1.0g、琼脂粉20.0g，121℃灭菌20min；Na2CO310.0g溶于1L水中，过滤灭菌后与上述所配溶液混合。木聚糖酶筛选培养基(1L)：固体LB中加入1%桦木木聚糖。卡那霉素抗性培养基(1L)：LB培养基加入卡那霉素(Kan)，终质量浓度为20mg/L。

1.3 方法

1.3.1 耐碱菌株的筛选

参考吴萍等[9]的方法稍作改变，称取土壤样品5g，放入装有45mL无菌生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，于水平摇床上振荡约30min。将梯度稀释后的菌悬液涂布于碱性培养基上，37℃培养5～7d。划线纯化出单菌落，保存。

将筛选出的耐碱菌点接于木聚糖酶筛选培养基中，37℃培养2d，观察水解圈。

1.3.2 木聚糖酶活性测定

参考Bailey等[10]的方法测定木聚糖酶活力。取100μL酶液加入900μL 0.5mol/L pH 6.8的Tris-HCl 缓冲液配成的质量浓度为2g/100mL木聚糖溶液，50℃水浴酶解15min。取250μL酶解液，加入750μL DNS，沸水浴反应10min，立即放入冰中冷却。加入5mL 蒸馏水，混匀，在540nm波长处测吸光度。以沸水浴15min灭活的酶液为对照。酶活力单位(U)：每毫升酶液每分钟水解木聚糖产生1μmol木糖的量。

1.3.3 细菌总DNA提取及16S rDNA鉴定

使用细菌总DNA提取试剂盒提取总DNA，以总DNA为模板，以27F和1492R为引物PCR扩增细菌16S rDNA[11]。27F：5＇-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT -3＇；1492R：5＇-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3＇。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.3.4 木聚糖酶基因的克隆

以细菌DNA为模板，参考碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)木聚糖酶基因xynA设计引物。为了避免PCR扩增时出现非特异性条带，本实验采用巢式PCR的方法，扩增菌株HSL38的木聚糖酶基因xyl-BH-G10。

在木聚糖酶基因开放式阅读框(ORF)两侧设计引物F1和F2。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，共进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。切胶回收约2400bp的片段，用作下一步PCR的模板。

使用分别加入酶切位点Bgl Ⅱ和XhoⅠ的引物F3和F4，以第一步PCR后胶回收片段为模板进行第二步PCR。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，共进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。切胶回收约1200bp的片段，取4μL胶回收产物与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Simple平末端连接，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选，菌液PCR筛选阳性克隆，由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

表1 巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers

1.3.5 表达载体及大肠杆菌重组子构建

提取重组质粒pEASY-Blunt-Simple-xyl-BH-G10，使用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切，胶回收目的片段xyl-BH-G10(约1200bp)。取目的片段与酶切后的载体pET-30a-c(+)于4℃过夜连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，于37℃培养12～16h，菌液PCR筛选阳性重组子。

1.3.6 基因序列分析

基因全长序列及开放阅读框使用DNAMAN 6.0软件分析。使用ClustalX、BLAST软件进行多序列比对。使用ProtParam tool对其分子质量、pI值等进行预测。

1.3.7 大肠杆菌重组子的培养与诱导表达

参考胡春霞等[12]的方法并改进，大肠杆菌重组子经过诱导条件优化，采用0.5mmol/L IPTG，32℃、200r/min诱导6h，表达重组蛋白，并以携带空载体pET-30a-c(+)的菌株和未经IPTG诱导的重组菌株为对照。收集超声波破碎后菌体裂解液上清和沉淀，进行蛋白电泳分析。

1.3.8 重组蛋白活性分析及其酶活测定

蛋白电泳[13]和活性电泳分析[14]：在分离胶中加入0.5g/100mL的木聚糖，进行SDS-PAGE。电泳结束后，使用25%异丙醇溶液于脱色摇床上振荡胶块30min，再使用0.5mol/L pH6.8的Tris-HCl缓冲液于4℃浸泡4次，每次30min，于50℃水浴反应1h，0.1g/100mL的刚果红染色30min，加入0.5%醋酸溶液，胶片观察灯下观察水解圈。

分别测定经IPTG诱导的重组菌株E.coli pET-30a-c(+)-xyl-BH-G10裂解液上清及菌株HSL38在37℃、200r/min发酵12h后上清液的酶活力，并以携带空载体的菌株和未经IPTG诱导的重组菌株裂解液酶活力为对照。各菌株均接种3瓶，分别收集酶液测定酶活力，用Excel 2007软件分析数据，计算标准偏差并制图。

2 结果与分析

2.1 耐碱菌株的筛选及鉴定

碱性培养基pH值范围为10.5～11.0，利用其筛选出耐碱性的微生物。将筛选所得耐碱微生物接种于木聚糖酶筛选培养基中，筛选得到具有木聚糖酶活性的菌株HSL38。16S rDNA鉴定与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans同源性达99%。初步鉴定菌株HSL38属于Bacillus halodurans。

2.2 木聚糖酶基因的扩增及序列分析

图1 xyl-BH-G10基因的PCR产物Fig.1 Electrophorogram of PCR amplified product of xyl-BH-G10 gene

根据菌株HSL38 16S rDNA鉴定结果，以Bacillus halodurans C-125的木聚糖酶基因xynA为参考，设计巢式PCR引物，进行扩增，最终得到约1200bp的片段，与xynA基因大小相符，结果见图1。

将基因xyl-BH-G10的PCR产物切胶回收，与克隆载体pEASY-Bunt-Simple进行平末端连接，蓝白斑筛选，获得阳性克隆，并测序，结果见图2。

基因xyl-BH-G10 与Bacillus halodurans C-125的xynA基因同源性达到99%，蛋白序列一致，编码396个氨基酸残基，属于糖基水解酶GH10家族。根据刘亮伟等[15]对木聚糖酶分子进化的研究表明，GH10家族的木聚糖酶从生物进化方面来看，其来源于高温环境；从三维结构来看，其结构为(β/α)8折叠桶，可结合更小的底物，产物中单糖较多。因此推测木聚糖酶xyl-BH-G10的温度稳定性较高，分解底物较彻底。利用ProtParam tool预测其蛋白质分子质量为45.27kD，pI值为4.66，融合His标签的重组蛋白分子质量为49.31kD。

2.3 重组表达载体的构建和转化

提取质粒pEASY-Blunt-Simple-xyl-BH-G10和质粒pET-30a-c(+)，使用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切质粒，分别切胶回收约1200bp(xyl-BH-G10)和约5400bp(pET-30a-c(+)线性载体)，在T4 DNA连接酶的作用下，4℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，菌液PCR鉴定为阳性菌株。

图3 重组载体及其酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid and restriction digestion

2.4 木聚糖酶基因xyl-BH-G10的表达

以带有空载体的菌株E.coli BL21(DE3)-pET-30a-c(+)和未诱导的菌株E.coli BL21(DE3)-pET-30a-c(+)-xyl-BH-G10为对照。经诱导表达后，收集菌体裂解上清液，进行SDS-PAGE电泳，结果见图4。

图4 重组大肠杆菌菌株裂解液SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of cell lysate of recombinant E. coli

从蛋白电泳可以看出，基因xyl-BH-G10在大肠杆菌中发生了截断表达，可能是由于蛋白水解酶将蛋白降解，也可能因为出现了新的翻译起始点[16]。分析基因xyl-BH-G10的序列，发现在+90处存在RBS(核糖体结合位点)AGGAGG，通过GENSCAN在线分析软件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)找出其开放式阅读框，并预测其分子质量为34.92kD，可能是木聚糖酶成熟蛋白。图4显示，在预测木聚糖酶成熟蛋白约35kD处有明显的蛋白条带，在约49kD处的蛋白条带，大小与加了His标签的木聚糖酶重组蛋白相似。并且，携带空载体的菌株在约35kD和约49kD处无蛋白表达，未经诱导的菌株有微量的本底表达。同时，从裂解液沉淀处的蛋白条带可以看出，在本实验的诱导表达条件下有部分包含体形成。于是，进一步进行活性电泳验证重组蛋白活性。

2.5 重组蛋白活性分析及其酶活力

图5 重组大肠杆菌菌株裂解液SDS-PAGE和活性电泳Fig.5 SDS-PAGE and native gel electrophoresis of cell lysate of recombinant E. coli

利用活性电泳验证重组蛋白的酶学活性，结果如图5所示。从木聚糖酶活性电泳看出，约35kD和约49kD处的蛋白均具有木聚糖酶活性，初步验证基因xyl-BH-G10所表达的蛋白及加了His标签的重组蛋白均具有木聚糖酶活性。进一步使用DNS法测定木聚糖酶活性，结果见表2。

表2 重组大肠杆菌和菌株HSL38木聚糖酶酶活力Table 2 Xylanase activities of recombinant E. coli and original HSL38 strain

从表2可以看出，在最佳诱导条件下，木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大肠杆菌细胞内高效表达，酶活达到55.28U/mL，是原菌株HSL38发酵液酶活的4倍。

3 结 论

本研究从红树林土壤中筛选出具有木聚糖酶活性的耐碱性菌株HSL38，并根据已有数据库资源克隆出该菌株的木聚糖酶基因xyl-BH-G10，对其进行原核表达，酶活力达到55.28U/mL，是原菌株HSL38发酵液酶活力的4倍。通过对xyl-BH-G10基因进行序列比对发现，该基因与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)β-1,4-木聚糖酶基因xynA的同源性达到99%，蛋白序列一致。同时，通过蛋白电泳和活性电泳发现，在本实验条件下，该基因在大肠杆菌中出现截断表达现象，但这不影响对基因功能的验证。根据梁艳丽等[17]的研究发现，xynA基因表达的蛋白，在pH4.5～9.0的条件下均有酶活力。Nishimoto等[18]研究碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125的碱性木聚糖酶XynA发现其活性中心的不同的质子供体氨基酸会影响到酶的pH值稳定性。通过研究蛋白结构探索不同来源木聚糖酶的酶学性质，并且定向进化木聚糖酶基因[19]，或者利用异源表达，构建基因工程菌[20]，成为今后木聚糖酶研究的方向。

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Cloning and Expression of Xylanase Gene from Alkaliphilic Bacillus halodurans

CHEN Na，SHENG Ji-ping，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In this study, an alkaliphilic strain (HSL38) producing xylanase was isolated from mangrove soil, and identified as Bacillus halodurans C-125 (GenBank: NC_002570.2) based on 16S rDNA analysis, which revealed a similarity of 99%. Specific primers based on theβ-1,4-xylanase gene xynA of Bacillus halodurans C-125 were designed, and theβ-1,4-xylanase gene (xyl-BH-G10) from HSL38 strain was amplified. Sequence analysis showed 99% similarity between the xynA gene and the amplified gene encoding a precursor of 396 amino acid residues (45.27 kD), which belonged to glycoside hydrolase family 10 GH10. A recombinant expression plasmid was constructed by linking xyl-BH-G10 to the expression plasmid pET-30a-c(+), and then transformed into E. coli BL21(DE3). The expression of recombinant protein was achieved under IPTG induction. These investigations indicated that theβ-1,4-xylanase gene xyl-BH-G10 was highly expressed in E. coli BL21 (DE3) cells under the optimal induction conditions, and an xylanase activity of 55.28 U/mL was obtained, which exhibited a 4-fold enhancement when compared to the fermentation of original HSL38 strain.

Bacillus halodurans；xylanase；cloning；expression

Q786

A

1002-6630(2011)05-0234-05

2010-09-26

国家公益性行业(农业)科研专项(200803033)

陈娜(1985—)，女，硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。E-mail：chenna0419@126.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，主要从事果蔬采后病理与农副产品资源综合利用研究。

E-mail：shen5000@gmail.com