李 文，王 陶

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

酸性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件研究

李 文，王 陶

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

从土壤中筛选到一株产酸性植酸酶酶活较高的菌株，初步鉴定为黑曲霉，菌株最优发酵条件为：麸皮3g/100mL、(NH4)2SO4 0.5g/100mL、发酵液初始pH5.5、发酵时间84h，酶活力可达12.06U/mL。对其粗酶液的酶学性质研究表明：该酶最适作用pH值为5左右，最适温度是45℃；该酶在55℃保温30min后酶活力保留在60%左右；在酸性和中性条件下有一定的稳定性；金属离子Ca2+、 Fe2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+对酶有一定的抑制作用，Mg2+、Ba2+对酶有一定的激活作用。

酸性植酸酶；筛选；发酵；酶学性质

近年来，饲用酶制剂以其高效、安全、低成本等特点，已成为饲料添加剂研究和应用的热点[1]。植酸酶就是其中之一。谷物饲料中50%～70%的磷是以植酸盐(肌醇六磷酸盐)的形式存在，单胃动物不能或很少分泌分解植酸的酶，使得人和动物内钙、镁、铁、锌等微量矿物质元素失衡[2-3]，植酸直接排出体外，又可导致水体的富营养化，对环境造成严重的磷污染[4-6]。植酸酶(EC.3.1.3.8)可催化肌醇六磷酸(盐或酯)脱掉磷酸基团[7]，从而提高饲料中磷的利用率，减少磷的排放，解除植酸盐的抗营养作用[8-9]。目前，植酸酶已经开始试用在植物性食品中，达到分解植酸磷，平衡营养的作用[10]。

植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物细胞中。产植酸酶的微生物有细菌、酵母和真菌等[7]。由于来源于

微生物的植酸酶作用范围和稳定性较好，易规模化生产，近几年的研究大都集中在微生物来源植酸酶[11]。根据最适pH值的不同，植酸酶可分为酸性植酸酶、中性植酸酶和碱性植酸酶[12]，其中，酸性植酸酶的酶促反应的pH值有效作用范围在2.5～5.5之间，适用于胃pH值呈酸性的单胃动物以及少数鱼类如虹鳟等[13]，能有效作用于单胃动物的消化道。故此，本实验拟从徐州地区的土壤中分离筛选产酸性植酸酶酶活较高的菌株，对其进行鉴定，并研究其酶学性质和发酵条件，以期为酸性植酸酶的应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土样：采自徐州市树林、菜地、动物园等处。

植酸钙 丹徒第一化工厂；植酸钠 美国Sigma公司；四水合钼酸铵 合肥工业大学化学试剂厂；三氯乙酸 天津市河东区红岩试剂厂；苯酚 天津市永大化学试剂开发中心；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH.B11.600-S-Ⅱ型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HYG旋式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司；DL-5低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 酸性植酸酶产生菌的初筛

1.3.1.1 初筛培养基

植酸钙1g/100mL、葡萄糖3g/100mL、NH4NO30.5g/100mL、KCl 0.05g/100mL、MgSO4·7H2O 0.05g/100mL、MnSO4·H2O 0.0018g/100mL、FeSO4·7H2O 0.003g/100mL、琼脂1.5g/100mL，pH5.5。同时制作pH4.5、pH3.5和pH2.5的初筛培养基。

1.3.1.2 初筛过程

取5g土样于45mL有玻璃珠的无菌生理盐水，于100r/min的摇床上振荡30min，静置，取上清液原液以及10-1、10-2的稀释液涂布初筛平板，于28℃条件下培养3～5d，从第24小时起以每12h观察透明圈产生情况，挑取透明圈直径与菌落直径比大的菌落于查氏培养基斜面(29±1)℃培养3～5d。

1.3.2 酸性植酸酶产生菌的复筛

1.3.2.1 复筛培养基

葡萄糖3g/100mL、(NH4)2SO40.2g/100mL、蛋白胨0.3g/100mL、KCl 0.05g/100mL、MgSO4·7H2O 0.05g/100mL、MnSO4·H2O 0.0018g/100mL、FeSO4·H2O 0.003g/100mL，pH5.5。

1.3.2.2 复筛过程

将菌株接种于锥形瓶中，于28℃、150r/min摇床培养3d。

1.3.3 酸性植酸酶活性的测定

植酸酶活性的测定参照文献[14]的方法进行。

酶活力单位定义：在温度37℃、pH5.5条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放lμmol无机磷即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

1.3.4 菌种遗传稳定性检测

将高产菌株连续传6代，分别摇瓶发酵测酶活力，检测菌株的遗传稳定性。

1.3.5 菌种的初步鉴定

观察菌落形态及菌丝形态，依据《真菌鉴定手册》鉴定菌种。

1.3.6 发酵条件的优化

1.3.6.1 碳源种类的优化

考察葡萄糖、蔗糖、乳糖、麸皮对酶活力的影响，取酶活力最大值所对应的碳源为最适碳源。

1.3.6.2 碳源质量浓度的优化

考察质量浓度分别为2、3、4、5、6g/100mL的碳源对酶活力的影响，取酶活最大值所对应的质量浓度作为最适碳源质量浓度。

1.3.6.3 氮源质量浓度的优化

改变(NH4)2SO4的质量浓度为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/100mL，分别进行酶活力测定，取酶活力最大时所对应的条件作为最适氮源质量浓度。

1.3.6.4 培养基初始pH值的优化

考察培养基初始pH值为3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7对酶活力的影响，取酶活力最大值所对应的pH值为发酵最适初始pH值。

1.3.6.5 培养时间的优化

从第24小时开始，每12h进行酶活力测定，以酶活力最高时的时间为最优发酵时间。

1.3.7 酸性植酸酶的酶学性质

1.3.7.1 酶作用的最适pH值

将植酸钠溶液用缓冲液配制成不同的pH值(1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)作为底物进行酶促反应，测定粗酶液的酶活。以最高酶活力为100%，在其他条件的酶活力占最高酶活力的百分数即为该酶在此pH值条件的相对酶活力。最高酶活力时的pH值即为最适pH值。

1.3.7.2 酶的pH值稳定性

采用不同pH值(1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)的缓冲液在37℃条件下处理酶溶液30min和60min，然后调回最适pH值，在常规条件下测定酶活力，并计算相对酶活力，考察酶在37℃条件下的pH值稳定性。

1.3.7.3 酶作用的最适温度

在不同温度条件下(25、35、37、45、55、65、75℃)进行酶促反应，测定酶活力。最高酶活力时的温度即为酶作用的最适温度。

1.3.7.4 酶的热稳定性

在不同温度条件下(35、45、50、55、60、65℃)处理粗酶液30min和60min，再在37℃条件下进行酶活力测定。

1.3.7.5 金属离子对酶活力的影响

在植酸钠溶液中添加质量浓度为0.1g/100mL的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、NaCl、KCl、Ba(OH)2，测定酶活力。研究金属离子对酶活力的影响。

2 结果与分析

2.1 酸性植酸酶产生菌的筛选与鉴定

图1 初筛的透明圈Fig.1 Transparent circles observed in primary screening of strains

对学校及学校周围的林场、菜地等多处取样地点所取的28批表层土样本和30批深层土样本进行筛选，其中表层土样成功两批，筛选得到的菌种均为细菌，深层土样成功8批，筛选得到的菌种有58株霉菌和6株细菌，所有菌株均在pH5.5的筛选培养基上筛到，在pH2.5的筛选培养基上也筛到一株霉菌。透明圈产生情况见图1。对透明圈与菌落直径比较大的菌进行液体发酵，提取粗酶液进行酶活力测定，酶活力较大的7株菌的酶活力见表1。其中1号霉菌的酶活力最高，为9.48U/mL，与其他菌株的酶活力之间具有极显著差异(P＜0.01)。

图2 单菌落形态特征Fig.2 Single colony morphology of strain 1 (with the highest phytase activity)

对1号菌株进行菌种鉴定，单菌落的形态特征见图2。菌落在査氏琼脂上生长迅速，菌落初白色，后变黑，28℃培养7d直径一般40～50mm，少数菌株生长较局限；平坦或中心稍凸起，有规则或不规则的辐射状沟纹；质地丝绒状或稍呈絮状，有的菌株偶有不育性过度生长；菌落表面有大量孢子，呈暗褐黑色至炭黑色；具有霉味；菌落反面无色或呈不同程度的黄色、黄褐色或带微黄绿色。通过40倍物镜观察到霉菌的显微结构，见图3。菌丝有隔膜，梗部有足细胞。有些分生孢子头分裂成几个圆柱状结构，可达500μm，产孢结构双层。分生孢子头为球形至辐射性，直径150～500μm，分生孢子梗壁光滑，长约800～4000μm，顶囊球形或近球形，直径40～70μm。实验研究该菌株与标准黑曲霉的个体形态完全相同[15-16]，综上特征，此酸性植酸酶产生菌初步鉴定为黑曲霉。

图3 菌株的个体形态特征(×400)Fig.3 Individual morphology of strain 1 (×400)

2.2 黑曲霉产酸性植酸酶的遗传稳定性

对筛选得到的黑曲霉进行6次传代，并分别测其酶活力，结果如表2所示。各代菌株与第一代菌株的酶活力均无显著性差异(P＞0.05)，表明该菌株有较好的遗传稳定性。

2.3 发酵条件初步优化

2.3.1 不同碳源对植酸酶酶活力的影响

由图4可以看出，利用麸皮作为产酶培养的碳源，酶活比使用其他碳源物质明显增高，同比葡萄糖增长30%，可能由于麸皮中含有某种成分，可以刺激黑曲霉分泌植酸酶，故以麸皮作为碳源。

表1 不同菌株所产酸性植酸酶的酶活力Table 1 Enzyme activities of strains producing acid phytase

表2 黑曲霉产酸性植酸酶的遗传稳定性Table 2 Genetic stability of strain 1

图4 不同碳源对植酸酶酶活力的影响Fig.4 Effect of carbon source on phytase activity

2.3.2 碳源质量浓度对植酸酶酶活力的影响

图5 麸皮质量浓度对植酸酶酶活力的影响Fig.5 Effect of wheat bran concentration on phytase activity

如图5所示，随着麸皮溶液质量浓度的增加，酶活力先上升，后下降，可能因为少量的麸皮对产酶有促进作用，过多的纤维存在对于产酶并没有明显的刺激作用，所以利用3g/100mL麸皮作为产酶培养的碳源。

2.3.3 (NH4)2SO4质量浓度对植酸酶酶活力的影响

图6 (NH4)2SO4质量浓度对植酸酶酶活力的影响Fig.6 Effect of (NH4)2SO4 concentration on phytase activity

如图6所示，(NH4)2SO4质量浓度为0.5g/100mL时黑曲霉产植酸酶的酶活力最高，质量浓度过高，反而会抑制植酸酶的活力。

2.3.4 培养基初始pH值对植酸酶酶活力的影响

图7 培养基初始pH值对植酸酶酶活力的影响Fig.7 Effect of initial culture pH on phytase activity

如图7所示，酸性范围内，酶活力先上升后下降，黑曲霉产的植酸酶活力在pH5.5的条件下最高，可能由于该株黑曲霉是在pH5.5的条件下筛选得到的，它最适宜这个pH值条件，也说明筛选出的黑曲霉产生的确为酸性植酸酶。故以pH5.5作为培养基的初始pH值。

2.3.5 培养时间对植酸酶酶活力的影响

图8 培养时间对植酸酶酶活力的影响Fig.8 Effect of culture time on phytase activity

利用最优的培养基，观察培养时间对植酸酶活力的影响，结果见图8。从第24小时开始，黑曲霉分泌的植酸酶就存在活力了，前60h的活力增长不是很明显，从第60小时开始，酶活力迅速提高，说明霉菌新增加的细胞数目和死亡的细胞数目达到动态平衡，数目达到最高峰，细胞开始大量进行累积代谢，当到达84h时，酶活力达到了峰值，为12.06U/mL。此后酶活力可能因为代谢活动所必需的物质减少而小范围的降低，因此，确定最佳发酵时间为84h。

2.4 酸性植酸酶的酶学性质

2.4.1 酸性植酸酶作用的最适pH值

由图9可以看出，该酶在pH2和5时酶活力都较高，符合酸性植酸酶的性质。

图9 pH值对植酸酶酶活力的影响Fig.9 Effect of reaction pH on phytase activity

2.4.2 酸性植酸酶的pH值稳定性

图10 酸性植酸酶的pH值稳定性Fig.10 pH stability of phytase

用不同pH值的缓冲液在37℃条件下处理粗酶液30、60min，然后调回最适pH值，在常规条件下测定酶活力，考察酶在37℃条件下的pH值稳定性，结果见图10。该酶在pH3时，只有40%左右的酶活力，而其他pH值之间均有50%以上的酶活力，延长处理时间，对酶活力的影响不大。此酶在酸性和中性的pH值条件下有一定的稳定性。

2.4.3 酸性植酸酶作用的最适温度

图11 温度对植酸酶酶活力的影响Fig.11 Effect of reaction temperature on phytase activity

从图11可以看出，酸性植酸酶的最适温度为45℃，在35～55℃都具有较高的酶活力，超过55℃后酶活力迅速下降。

2.4.4 酸性植酸酶的热稳定性

图12 酸性植酸酶的热稳定性Fig.12 Thermal stability of phytase

从图12可以看出，在50℃保温30min后酶活力保留在80%左右，在55℃保温30min后酶活力仍能保留在60%以上，之后酶活力就迅速降低，65℃几乎没有酶活力。延长处理时间对酶的热稳定性影响不大。

2.4.5 金属离子对酸性植酸酶酶活力的影响

表3 金属离子对酸性植酸酶酶活力的影响Table 3 Effect of metal ions on phytase activity

由表3可以看出，各种金属离子与无添加金属离子的酶活力相比均有显著性差异。Ca2+、Fe2+、Na+、K+对酶活力有一定的抑制作用，Zn2+、Cu2+对酶有很大的抑制作用，可能这些离子可以和底物植酸钠发生很强的络合作用，是该酶的抑制剂；Mg2+、Ba2+对酶有一定的激活作用，是该酶的激活剂。

3 结 论

从土壤中筛选到一株产酸性植酸酶酶活力较高的菌株，初步鉴定为黑曲霉，对该菌株液体发酵产酶条件进行初步优化，最优条件为：麸皮3g/100mL、(NH4)2SO40.5g/100mL、发酵液初始pH5.5、发酵时间84h，此时酶活力可达12.06U/mL，此酶活高于目前报道的天然筛选的黑曲霉的酶活力，这可能与此菌株不同的生长环境有关，或是菌株发生了突变，使得酶活力较高。此菌株有一定的应用潜力，为下一步的遗传改良以更进一步的提高酶活力打下很好的基础。

对该酸性植酸酶粗酶液的酶学性质研究表明：该酶的最适pH值为5左右，最适温度是45℃；耐热性方面，该酶在55℃保温30min后酶活保留在60%左右，之后迅速下降；该酶在酸性和中性条件下有一定的稳定性；金属离子 Ca2+、Fe2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+对酶有一定的抑制作用，Mg2+、Ba2+对酶有一定程度的激活作用，因此，可考虑在发酵时加入这些金属离子，以增大酶活力。另外，为适应饲料制粒过程中的高温过程，可对该酸性植酸酶的耐热性进行遗传改良，以更好地发挥其作用。

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Screening and Identification of a Strain Capable of Producing Acid Phytase and Optimization of Its Fermentation Conditions

LI Wen，WANG Tao
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

A strain with higher acid phytase activity isolated from soil was identified as Aspergillus niger. The optimal fermentation conditions for improved production of phytase by the strain were incubation in a medium composed of 3 g/100mL wheat bran and 0.5 g/100mL (NH4)2SO4, at an initial pH of 5.5 for 84 h. Under the optimal fermentation conditions, the phytase activity was up to 12.06 U/mL. The optimal reaction pH and temperature of this enzyme were 5 and 45 ℃, respectively. The relative enzyme activity remained to be 60% after heating treatment at 55 ℃ for 30 min. In addition, the enzyme was stable in acidic and neutral media. The phytase activity was inhibited by Ca2+, Fe2+, Na+, K+, Zn2+and Cu2+, while activated by Mg2+and Ba2+.

acid phytase；screening；fermentation；enzyme property

Q93.331

A

1002-6630(2011)05-0228-06

2010-06-21

江苏省高校自然科学研究面上项目(10KJD180006)；徐州工程学院科研基金青年课题(XKY2009122)

李文(1982—)，女，讲师，硕士，研究方向为微生物发酵。E-mail：wenlisony@126.com