周国利，郭 彦，方 翔，吴玉厚

(聊城大学生命科学学院，山东 聊城 252059)

鸡CAPN1基因多态性及其与肉质性状的关联分析

周国利，郭 彦，方 翔，吴玉厚

(聊城大学生命科学学院，山东 聊城 252059)

采用聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)方法对147只寿光鸡CAPN1基因第4外显子进行多态性检测，分析其与部分肉质性状的关系。在CAPN1基因第4外显子上共检测到3种基因型AA、AB和BB，它们的基因型频率分别为0.286、0.510和0.204。方差分析结果表明：在寿光鸡群体中，BB基因型个体的胸肌pHu值显著高于AA基因型个体(P＜0.05)；AA基因型个体的肌内脂肪含量显著高于BB基因型个体(P＜0.05)。

寿光鸡；聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)；CAPN1基因；肉质性状

中国的肉类产量居世界第一，中国肉类加工工业保持着较快的增长势头，肉类总产量年均增长4.8%，尤其由于禽肉口感好，易烹饪，营养丰富，深受人民群众的欢迎[1]。随着人民生活水平的不断提高，人们对禽畜肉产品的要求也有了进一步的提高。不仅要求肉品安全，营养丰富，而且要有较好的口感和风味。鸡肉是重要的禽肉产品之一，其品质的优劣直接影响到消费者对它的接受程度及饲养者和销售者的经济利益，因此提高鸡的肉质品质对畜牧业来说具有非常重要的经济意义。

钙蛋白酶(calpain)广泛存在于各组织，广泛表达的钙蛋白酶有两种：钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶Ⅱ，CAPN1是细胞质中主要的蛋白水解酶，在肌原纤维蛋白降解中起着重要的作用[2]。禽类CAPN1基因序列与哺乳动物同源性较低，这可能是进化上的差异导致的[3]。鸡与其他动物在各组织中的表达谱也是有差异的[4]。在活体动物中，很多学者认为该系统与动物的肌肉生长发育有关，而在动物宰后与肉的嫩度密切相关[5-6]。随着分子生物学的发展，国内外已经开始了钙激活酶系统基因水平的初步研究[7-8]。逐步筛选控制该酶系统的基因，并大幅度增加对其基因多态性的研究[9]，旨在进一步研究钙激活酶系统在肉成熟嫩化过程中的作用机理、培育高品质畜禽品种。

寿光鸡，又叫慈伦鸡。寿光鸡的特点是体型硕大、蛋大。寿光鸡肉质鲜嫩，营养丰富。属肉蛋兼用的优良地方鸡种。本实验以鸡CAPN1基因为肉质性状候选基因，对寿光鸡CAPN1基因外显子4进行多态性检测，并在寿光鸡群体中分析其多态性与肉质性状的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以同一条件下饲养9周龄左右的147只寿光鸡为材料，翅静脉采血，抗凝剂抗凝，置于冰盒，带回实验室用于DNA的提取。柱式全血基因组抽提试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 仪器与设备

ND-1000紫外-可见分光光度计 NanoDrop公司；高速冷冻离心机 德国Beckman公司；Alpha ImagerTM2200凝胶成像系统 安玛西亚公司；PTC-225 PCR仪MJ. Research公司；DYY-2Ⅲ稳压电泳仪 北京市六一仪器厂；C-LM3型嫩度仪由东北农业大学生产；PHS-25数显pH计 上海智光仪器仪表有限公司。

1.3 肉质性状表型的测定

胸肌和腿肌的pHu值、肌内脂肪含量、胸肌和腿肌剪切力、胸肌失水率、胸肌和腿肌蒸煮损失参照赵小玲等[10]和林丽超等[11]的方法测定、肌红蛋白含量参照Trout等[12]的方法测定。

1.4 引物设计和PCR扩增

根据鸡CAPN1基因的DNA序列(GenBank登录号：NC_006090)，用DNAMan5.0和Oligo6.0结合设计鸡CAPN1基因外显子4的特异引物(包括外显子4两侧的部分内含子区域)，引物合成由北京华大基因有限公司完成。引物序列：上游引物：5＇-GGATGCCCTGTTCTGCTC AC-3＇；下游引物：5＇-GGTCGGACTCACTTGGC GTA-3＇，扩增片段长180bp左右。

鸡血样基因组DNA的提取用柱式全血基因组抽提试剂盒提取，提取后的DNA用TE缓冲液溶解后，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计测定浓度后，－20℃保存备用。PCR扩增反应体系为25μL，其中含有约50ng基因组DNA，10pmol/L的引物，200 μmol/L的dNTPs，1.5mmol/L MgCl2，1.25U Taq酶。样品经94℃变性3min后，按下列程序进行扩增：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃延伸7min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR-SSCP多态性检测

取2μL PCR产物和5μL的上样缓冲液(98%甲酰胺、0.025g/100mL溴酚蓝、0.025g/100mL二甲苯氰、10mmol/L EDTA(pH8.0))置于PCR管中，离心混匀，98℃变性10min，迅速插入冰中，放置10min，使之保持变性状态。样品用12% 非变性聚丙烯酰胺(V丙烯酰胺:V甲叉双丙烯酰胺=29:1)凝胶电泳进行检测。电泳结束后，进行银染显带。拍照，进行基因型分析并记录结果。

1.6 统计分析

基因频率和基因型频率分析：采用Popgene Version

1.31软件进行分析。

杂合度(heterozygosity，He)表示群体在某座位为杂合子的比例，反映群体遗传变异程度的大小[13]。由等位基因频率计算杂合度，群体内某一座位的杂合度计算如式(1)。

式中：i为第i个等位基因；pi为第i个等位基因的频率；n为等位基因数。

有效等位基因数(effective number of allele，Ne)也是反映群体遗传变异大小的一个指标，它表明等位基因在群体中分布越均匀，有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数。其值为纯合度的倒数[14]。

多态信息含量(polymorphism information content，PIC)值是根据其等位基因在一个群体中的频率来计算的，表示位点多态性高低[15]。

式中：pi和pj分别为第i个和第j个等位基因的频率；n为等位基因数。

线性模型建立：构建了最小二乘分析模型来分析所发现的多态位点与肉质性状指标的关系。其一般线性模型为：

式中：Yij为性状的观察值；μ为群体平均值；Genotypei为第i种标记基因型的固定效应；eij为随机残差效应。用SPSS11.0的一般线性模型(general liner model，GLM)过程完成。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果分析

图1 CAPN1基因外显子4的PCR扩增电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products for the exon 4 of CAPN1 gene

用设计的引物分别对不同个体鸡的基因组DNA进行PCR扩增，所得PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果发现对引物的扩增片段与目的片段大小一致，长度大约为180bp，目的条带清晰(图1)，特异性好，可直接用于SSCP 分析。

表1 寿光鸡CAPN1外显子4的群体遗传学参数Table 1 Population genetic parameters of exon 4 in Shouguang chicken

2.2 PCR-SSCP检测结果

图2 CAPN1基因外显子4的PCR-SSCP电泳结果Fig.2 Electrophoresis of PCR-SSCP for the exon 4 of CAPN1 gene

对147只寿光鸡扩增产物用12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，结果如图2所示，发现CAPN1基因第4外显子含有3种不同基因型，分别命名为AA、AB和BB。

2.3 PCR-SSCP遗传多态性分析

从表1可以看出，在寿光鸡群体中，该座位共发现了AA、AB和BB 3种基因型，AB基因型个体占绝大多数，AA和BB基因型个体数量基本相当。而A和B两个等位基因的出现的频率基本上是一致的。多态信息含量为0.373，属于中度多态，有效等位基因数为1.987，观察杂合度略高于期望杂合度。χ2检验结果显示，群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。

2.4 PCR-SSCP多态性与肉质性状的分析

表2 CAPN1基因外显子4不同基因型肉质性状的最小二乘均值及标准差(±s)Table 2 Least squares mean and standard deviation for meat quality traits in Shouguang chicken with different genotypes of CAPN1 gene (±s)

表2 CAPN1基因外显子4不同基因型肉质性状的最小二乘均值及标准差(±s)Table 2 Least squares mean and standard deviation for meat quality traits in Shouguang chicken with different genotypes of CAPN1 gene (±s)

注：同一行数据肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)；pHu.屠宰24h后的pH值。

性状 基因型AA AB BB胸肌pHu 6.05±0.36b 6.20±0.37ab 6.34±0.37a腿肌pHu 6.43±0.40 6.36±0.74 6.41±0.53肌红蛋白含量/(μmol/g)2.04±1.04 2.03±0.82 2.00±0.84肌内脂肪含量/% 4.95±0.95a 3.73±0.72ab 2.67±0.56b胸肌剪切力/N 16.07±2.12 15.68±1.98 16.46±1.01腿肌剪切力/N 16.37±2.54 16.46±2.08 16.66±1.76胸肌失水率/% 6.56±1.57 6.59±1.99 7.22±1.91胸肌蒸煮损失/% 20.85±5.27 21.31±4.36 22.69±4.02腿肌蒸煮损失/% 20.15±4.56 21.01±4.02 22.32±3.92

通过构建最小二乘线性模型，分析了CAPN1基因外显子4的多态性与寿光鸡肉质性状的关系。从表2可知，在寿光鸡群体中，BB基因型个体的胸肌pHu值显著高于AA基因型个体(P＜0.05)；AA基因型个体的肌内脂肪含量显著高于BB基因型个体(P＜0.05)。其他性状指标在不同基因型之间差异不显著。

3 讨 论

关于CAPN1基因在不同鸡品种中的多态性研究，最近有了一些报道，研究表明CAPN1在不同鸡品种(系)中都存在多态性[16-17]。但本实验率先分析寿光鸡群体CAPN1基因第4外显子的SSCP多态性，发现寿光鸡群体在该座位存在3种基因型(AA、AB和BB)和两个等位基因(A和B)，A和B两个等位基因的频率基本相当。所研究的寿光鸡群体在该座位处于Hardy-Weinberg平衡状态，这说明寿光鸡的人工选育程度是非常低的。

Botstein等[15]提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量参数，当PIC＞0.50时，该基因座位为高度多态基因座；0.25＜PIC＜0.50时为中度多态基因座；PIC＜0.25时为低度多态基因座。有效等位基因数是基因纯合度的倒数，反映了等位基因的相互影响，也可作为群体遗传变异的一个参数。Hines等[14]指出等位基因在群体中分布越均匀，有效等位基因数就越接近所检测到的等位基因的绝对数。杂合度反映群体在多个基因座上的遗传变异，一般认为它是度量群体遗传变异的一个最适参数[13]。据此，在CAPN1基因外显子4的实验中，可得出它的多态性程度属于中度多态，有效等位基因数接近观察等位基因数，杂合度也较高。这说明寿光鸡群体的遗传多样性较高，该品种具有较大的选择潜力。高海军等[18]采用PCR-SSCP方法对清远麻鸡的CAPN1基因外显子4部分序列、内含子4和外显子5部分序列进行单核苷酸多态性分析，共检测到AA、AB、AC、BB、BC和CC 6种基因型，在该多态座位上的PIC为0.5909，为高度多态，杂合度水平也较高，与本实验结果基本一致。

对牛基因研究发现，在该基因的第316位和530位的氨基酸发生突变，并且与牛的嫩度呈显著相关，并且这两个标记在商业中已经被评估或应用[19-21]。在鸡的群体中，关于准确影响肉质性状的标记还不是非常明确，研究者也正在进行大量的研究来寻找影响鸡肉质性状的相关标记[22-24]。本研究结果表明寿光鸡CAPN1基因外显子4的PCR-SSCP多态性位点与鸡的胸肌pHu值和肌内脂肪含量等性状都有一定的相关。CAPN1基因外显4座位中的BB基因型个体的胸肌pHu值显著高于AA基因型个体(P＜0.05)，这表明对肉品的货架寿命来说BB基因型是优势基因型。AA基因型个体的肌内脂肪含量显著高于BB基因型个体(P＜0.05)，而且肌内脂肪含量与肉的嫩度程正相关。许多报道显示，肌内脂肪含量对肉食用品质有积极的影响，肌内脂肪对肉的嫩度、多汁性和风味特性均具有改善作用。从这个角度来说，AA基因型对于肉质嫩度、多汁性和风味特性具有一定改善作用，但是否会满足不同消费群体的需求，还需根据不同的育种目标来进行确定如何进行选择。

总之，CAPN1基因外显子4在寿光鸡的群体中遗传变异程度较高，而与寿光鸡的部分肉质性状存在一定的关联性，可以初步使用该多态性位点(CAPN1-Exon4)对寿光鸡的部分肉质性状进行标记辅助选择。

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Polymorphism of CAPN1 Gene and Its Correlation with Meat Quality Traits in Shouguang Chicken

ZHOU Guo-li，GUO Yan，FANG Xiang，WU Yu-hou
(College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China)

Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) method was used to determine the polymorphism of exon 4 of CAPN1 gene in 147 Shouguang chicken, and analyze the correlation between CAPN1 gene and meat quality traits in Shouguang chicken. Three genotypes were identified as AA, AB and BB with the genotype frequencies of 0.286,0.510 and 0.204, respectively. Statistical analysis indicated that type BB Shouguang chicken had significantly higher breast muscle pHu value than type AA (P＜0.05). However, type AA Shouguang chicken had significantly higher content of intramuscular fat than type BB (P＜0.05).

Shouguang chicken；PCR-SSCP；CAPN1 gene；meat quality traits

S831.2；R393.11

A

1002-6630(2011)05-0207-04

2010-06-22

山东省自然科学基金项目(Y2007D33)

周国利(1975—)，男，副教授，博士，研究方向为分子遗传学与动物育种。E-mail：glzhou1975@163.com