张 琴，李艳宾，曹亚龙

(1.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学 塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

棉秆稀酸水解及微生物共发酵生产单细胞蛋白工艺优化研究

张 琴1,2，李艳宾1,2，曹亚龙1

(1.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学 塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

通过正交试验确定稀酸水解棉秆的最优工艺，以纤维素含量最高，木质素含量最少为优选标准，得到优化工艺条件为：硫酸体积分数1.0%、固液比1:15，于100℃条件下水解2.0h，以此发酵工艺获得稀酸水解棉杆用于后续发酵工艺研究中。采用Plackett-Burman设计法，从酵母菌接种量、酵母菌接种时间、青霉接种量、共发酵时间、起始pH值、含水量、温度、麸皮含量和装料量9个因素中筛选出装料量、麸皮含量、共发酵时间、青霉接种量4个主要影响因素，并通过响应面分析法对工艺条件进行优化，获得的最优工艺条件为：青霉接种量10%、麸皮含量4%、装料量为发酵罐头瓶体积(250mL)的1/3、共发酵时间53h，在此基础上进行验证实验，得到单细胞蛋白含量的平均值为25.38%，与模型的理论预测值(22.79%)仅相差2.59%，说明建立的模型是切实可行的。

棉秆；稀酸水解；微生物；共发酵；单细胞蛋白

棉花秸秆是新疆广泛存在的生物质资源，在新疆，每年大约有600～750万t棉秆产生[1-2]。棉花秸秆中木质纤维素含量较高，粗蛋白含量约6.5%[3-4]，魏敏等[4-5]对棉秆的饲用价值进行了评价，并研究了其作为绵羊粗饲料的消化情况，认为棉秆是一类有一定粗蛋白含量但干物质有效降解率和代谢能都较低的粗饲料且纤维素消化率极低，这可能和棉秆木质素含量高有关。为此，如何提高棉秆中的粗蛋白含量，提高纤维素消化率已成为棉秆饲喂中亟待解决的问题。

蛋白质含量是衡量动物粗饲料品质的主要指标之一[6]。近年来，利用有益微生物发酵分解秸秆中的纤维素生产单细胞蛋白(single cell protein，SCP)已成为饲料工业中的研究热点之一[7]。SCP主要来自微生物包括霉菌、酵母菌和细菌等的培养[7]，秸秆纤维素SCP的生产与纤维素原料的选择、微生物菌种的发酵密切相关。秸秆中除含一定量的粗蛋白外，主要还存在木质纤维素成分，为此在相关研究中多采用双菌种混合发酵，即通过对纤维素和半纤维素降解能力较强的霉菌和酵母菌共发酵生产单细胞蛋白[8-9]。Xiao等[10]利用不同微生物固态发酵水生大型植物生产粗蛋白，结果表明通过黑曲霉和热带假丝酵母共发酵获得的粗蛋白含量最高。本研究基于棉秆的木质纤维素和粗蛋白组成特性，首先通过稀酸水解获得纤维素含量较高的酸解棉秆，再采用Plackett-Burman设计法和响应面法，对影响酸解棉秆微生物共发酵生产单细胞蛋白的发酵条件进行考察和评价，对影响发酵的重要因素及其交互作用进行研究和探讨，建立适宜于酸解棉秆微生物共发酵的数学模型，获得较高的单细胞蛋白产量，从而为棉秆的高效利用和单细胞蛋白的生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棉秆采自新疆阿拉尔棉田，风干、粉碎，过20目筛，备用。

1.2 菌种与培养基

热带假丝酵母(Candida tropicalis CICC 1779)购自中国工业微生物菌种保藏中心。青霉菌Q59：为本研究室分离保存的能水解糖化棉秆的菌种。

酵母菌活化培养基：麦芽粉5g，pH值自然。酵母菌种子培养基：麦芽粉5g、(NH4)2SO42g、KH2PO41g、MgSO40.5g、pH6.0。青霉种曲：麸皮，添加营养液(营养液的组分及配比：KH2PO40.2g/100mL、(NH4)2SO43g/100mL、MgSO40.05g/100mL)，pH6.0，调节含水量为70%。共发酵培养基：酸解棉秆≤85%，麸皮(按设计量添加)、添加营养液(营养液的组分及配比：KH2PO40.2g/100mL、(NH4)2SO43g/100mL、MgSO40.05g/100mL)，起始pH值和含水量按试验设计调节。

1.3 仪器与设备

ZN-200A微型高速粉碎机 中南制药机械厂；AR1140精密电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F超净工作台、HPX-9272MBE数显电热培养箱、GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱、HHS-21-4电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；UV754N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.4 测定方法

1.4.1 纤维素和木质素含量测定

采用van Soest等[11]的方法进行测定。

1.4.2 蛋白质含量测定

采用半微量凯氏定氮法[12]进行检测。

1.5 试验设计方法

1.5.1 棉秆稀酸水解正交试验设计

结合前人[13-14]关于棉秆和玉米秸秆稀酸水解的研究结果，选取硫酸体积分数、水解时间、水解温度和固液比4个主要因素，进行正交试验，考察其对纤维素和木质素含量的影响，正交表选用L16(45)，因素与水平设置见表1。

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.5.2 Plackett-Burman(P-B)设计

Plackett-Burman(P-B)设计法是一种近饱和的两水平试验设计方法，能快速有效地从众多考察因素中筛选出最重要的几个因素[15]。根据有关参考文献[16]的结果，应用Plackett-Burman(P-B)试验设计法筛选重要影响因素。Plackett-Burman(P-B)试验因素及水平见表2。

表2 Plackett-Burman设计试验因素与水平表Table 2 Factors and levels in Plackett-Burman design

1.5.3 Box-Behnken设计及响应面分析

根据Plackett-Burman(P-B)试验设计法所筛选出的4个重要因素，利用SAS V8.0统计分析软件进行试验Box-Behnken设计，并进行响应面分析，从而确定4个因素的最佳水平。

2 结果与分析

2.1 正交试验确定棉秆稀酸水解最优工艺

表3 稀酸水解L16(45)正交试验结果Table 3 Orthogonal array design layout and experimental results

棉秆稀酸水解正交试验结果见表3，根据极差R的大小判断，各因素对纤维素含量影响的主次顺序为：A＞C＞B＞D，即硫酸体积分数＞水解温度＞水解时间＞固液比；对木质素含量影响的顺序依次为：D＞A＞C＞B，即固液比＞硫酸体积分数＞水解温度＞水解时间。

作为一种木质纤维素，棉秆的稀酸水解会引起木质纤维素成分含量的变化，为利于后续发酵的进行，水解工艺以纤维素含量最高、木质素含量最少为优选标准。从表3可以看出，A因素选取水平2，B因素选取水平4，酸解棉秆纤维素含量最高、木质素含量最低；C因素选取水平4和1，纤维素含量高且两水平间无显著差异，考虑木质素含量于水平1显著较低，故C因素选取水平1；D因素选取水平3和4，纤维素含量高且各水平间无显著差异，而木质素含量在这两个水平中以水平3含量最低，故D因素选择水平3。所以最优水平组合可确定为A2B4C1D3，即优化工艺参数为：硫酸体积分数1.0%、水解时间2.0h、水解温度100℃、固液比1:15。

表4 正交试验方差分析表Table 4 Variance analysis for orthogonal array design

从表4可以看出，硫酸体积分数、水解温度和水解时间对纤维素含量的影响均达到极显著水平，固液比对其影响不显著；硫酸体积分数、固液比对木质素含量的影响极显著，水解温度和水解时间对其影响不显著。

由于表3中没有A2B4C1D3组合，对其进行了验证实验，纤维素含量为44.13%，木质素含量为25.48%。经比较，最终确定A2B4C1D3为最佳对其稀酸水解工艺组合。

2.2 Plackett-Burman设计筛选重要因素

选用n=12的Plackett-Burman设计，对酵母菌接种量、酵母菌接种时间、青霉接种量、共发酵时间、起始pH值、含水量、温度、麸皮含量和装料量9个因素进行研究，发酵试验设计及结果见表5。

采用SASV8.0进行各因素主效应分析结果见表6。从表6可以看出，在9个与发酵相关的因素中，影响效果为X9＞X8＞X6＞X3＞X4＞X5＞X7＞X2＞X1，最后筛选出装料量、麸皮含量、共发酵时间、青霉接种量4个主要影响因素，并且4个因素均达到了95%的显著水平(P＜0.05)。

表6 Plackett-Burman试验统计分析结果Table 6 Statistic analysis results of Plackett-Burman design

2.3 响应面分析法确定重要因素的最佳水平

2.3.1 响应面试验因素水平设计

通过上述Plackett-Burmen设计得到的结果可知，各因素水平可按表6中的效应值选取适当的水平，并分析出：装料量、麸皮含量、共发酵时间、青霉接种量为影响青霉及假丝酵母共发酵酸解棉秆生产单细胞蛋白结果的4个主要因素，根据其效应值的大小安排为4个因素3个水平共27个试验点的响应面分析实验，因素与水平见表7。

表7 响应面分析试验因素与水平表Table 7 Factors and levels in response surface design

2.3.2 响应面分析试验设计及结果

响应面分析通过27次试验完成，以蛋白质含量为响应值，结果见表8。运用SAS软件对表8结果进行二次回归分析，得到二次回归方程为：Y=21.58＋1.39X1＋0.88X2＋2.37X3＋1.28X4＋2.63X1X2－0.22X1X3＋0.66X1X4＋0.88X2X3－0.66X2X4＋0.77X3X4－2.97X12－1.44X22＋0.26X32－1.93X42。对回归方程求解，当响应值Y有最大值时可求得各因素的编码值为：X1=0.0741，X2=－0.5820，X3=－3.2965，X4=－0.2115，即最佳发酵条件为：青霉接种量10%、共发酵时间53h、麸皮含量4%、装料量为发酵罐头瓶体积(250mL)的 1/3。

表8 Box-Behnken响应面试验设计及响应值Table 8 Box-Behnken response surface design scheme and experimental results

对回归方程进行方差分析和显著性检验，结果见表9、10。从表9可以看出，模型P=0.0030＜0.05，表明回归模型显著，复相关系数R2为86.19%，说明该模型拟合程度良好，误差小，表明回归方程可较准确地预测不同条件下单细胞蛋白的含量。

回归模型系数显著性检验结果(表10)显示，在α=0.01水平上，因素X3对蛋白质含量的线性效应显著，二次项X12对蛋白质含量的曲面效应显著；在α=0.05水平上，因素X1、X4对蛋白质含量的线性效应显著，交互项X1X2、二次项X42对蛋白质含量的曲面效应显著。

表10 回归方程系数显著性检验Table 10 Significance test of each regression coefficient of the established regression equation

图1为四因素交互作用的曲面图和等高线图，曲面图有极大值，即为稳定点。X1和X2交互作用的等高线为椭圆形，说明两因素间交互作用显著。其余等高线为近圆形，说明两因素间交互作用不显著。

图1 蛋白质含量的响应面及其等高线图Fig.1 Response surface and contour plots for the pairwise interactive effects of three variables on protein content

2.3.3 验证实验

根据上述结果进行验证实验，3次重复实验结果表明蛋白质平均含量为25.38%，模型的理论预测值为22.79%，二者仅相差2.59%，可见该模型可以较好地反映出青霉及假丝酵母共发酵酸解棉秆生产单细胞蛋白的工艺条件，说明建立的模型切实可行，具有一定的实践指导意义。

3 结 论

通过正交试验获得了酸解棉秆中纤维素含量较高、木质素含量较低的棉秆稀酸水解优化工艺条件：硫酸体积分数1.0%、固液比1:15于100℃条件下水解2.0h，以此发酵工艺获得的酸解棉秆纤维素含量高，有利于后续微生物发酵的进行。

从酵母菌接种量、酵母菌接种时间、青霉接种量、共发酵时间、起始pH值、含水量、温度、麸皮含量和装料量9个因素中筛选出了装料量、麸皮含量、共生发酵时间、青霉接种量4个主要影响因素，其中装料量、麸皮含量和青霉接种量三因素在后续的响应面分析试验中，在α=0.01和α=0.05水平上对蛋白质含量的线性效应显著，说明筛选的因素都是较重要的发酵影响因子。

响应面法优化了酸解棉秆的发酵条件，获得的最优工艺条件为：青霉接种量为10%、麸皮含量4%、装料量为发酵罐头瓶体积(250mL)的1/3、共发酵时间53h，在此基础上进行验证实验，得到单细胞蛋白含量的平均值为25.38%，与模型的理论预测值(22.79%)仅相差2.59%，说明建立的模型是切实可行的。

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Acid Hydrolysis of Cotton Stalks and Single Cell Protein Production by Microbial Co-fermentation

ZHANG Qin1,2，LI Yan-bin1,2，CAO Ya-long1
(1. College of Life Sciences, Tarim University, Alaer 843300, China；2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Tarim University, Alaer 843300, China)

The optimal process for the hydrolysis of cotton stalks with dilute acid was investigated by orthogonal array design on the basis of the highest cellulose content and the lowest lignin content. The optimal acid hydrolysis conditions for cotton stalks was dilute acid concentration of 1.0%, solid-to-liquid ratio of 1:15, hydrolysis temperature of 100 ℃ and hydrolysis time of 2.0 h. Plackett-Burman design was used to screen 4 major factors including material-loading amount in a 250 mL fermentation vessel, bran content, co-fermentation time and Penicillium inoculation amount from 9 factors such as yeast inoculation amount,yeast inoculation time, Penicillium inoculation amount, co-fermentation time, initial pH, water content, temperature, bran content and material-loading amount, and their optimum levels were determined by response surface methodology to be 1/3, 4%, 53 h and 10%, respectively. An average content of single cell protein of 25.38% was obtained in validation experiments developed under the optimal parameters, between which and the theoretical value of 22.79%, there was 2.59% difference. Therefore, this established model is feasible.

cotton stalk；acid hydrolysis；microbes；co-fermentation；single cell protein (SCP)

TQ920.9

A

1002-6630(2011)05-0192-06

2010-06-23

国家自然科学基金项目(30860014)；新疆生产建设兵团高新技术项目(2007GX21)

张琴(1980—)，女，讲师，硕士，研究方向为生物质资源的微生物转化。E-mail：jhtabszq@163.com