古丽斯玛依·艾拜都拉，艾尼江·尔斯满，木合塔·阿不都克里木,*，谢仁娜依·甫拉提，孜来古丽·米吉提，赵 建，艾尔肯·热合曼

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆师范大学生命科学与化学学院，新疆 乌鲁木齐 830054 )

碱性果胶酶产生菌Bacillus claussi XJU-8的分离鉴定及酶学特性分析

古丽斯玛依·艾拜都拉1，艾尼江·尔斯满1，木合塔·阿不都克里木1,*，谢仁娜依·甫拉提2，孜来古丽·米吉提1，赵 建1，艾尔肯·热合曼1

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆师范大学生命科学与化学学院，新疆 乌鲁木齐 830054 )

从新疆石河子市一处工业污水(pH11.0)中分离到一株碱性果胶酶产生菌，编号XJU-8。应用形态学检测、生理生化实验、16S rDNA序列分析、系统进化分析对菌株进行多相鉴定。XJU-8可在pH5.0～13.0的LB培养基上生长，最适生长温度37℃。16S rDNA序列构建的系统进化树表明XJU-8与Bacillus claussi类聚在一起，而且序列同源性高达99%以上。XJU-8与B.claussi GMBAE 42在氧化酶，柠檬酸盐利用和水解Tween-40、Tween-60上有差异，且XJU-8有宽范围pH值耐受性，被认为是B.claussi的一个新品系。该菌产生的碱性果胶酶最适pH10.0，最适温度50℃，在pH9.0～12.0有较高活性和稳定性。酶活性可被Ca2+盐激活。XJU-8所产碱性果胶酶特性良好，工业应用潜能巨大。

Bacillus claussi；16S rDNA；系统进化树；碱性果胶酶

果胶是细胞间质和高等植物初生细胞壁结构的主要多糖[1]。作为细胞间质和细胞壁的成分，果胶是一种天然的物质，而且是所有水果蔬菜的主要成分。化学成分上它是一种以侧链甲基化的D-半乳糖醛酸为骨架形成的杂多糖[2-3]。

果胶酶是具有果胶降解活性的一种酶，在食品工业中用于提高产品质量和果汁的透明度[4]，在纺织工业中广泛地应用于亚麻茎脱纤维，代替了传统的脱胶工艺[5]。微生物果胶酶在人类生产活动中具有不可替代的用途，目前酸性果胶酶已广泛应用于果胶的提取、果汁和酒类的澄清中[4,6]。碱性果胶酶主要用于蔬菜食品加工厂排出的含果胶质的污水预处理和大麻、苎麻、亚麻、黄麻等植物纤维的加工、脱胶及解聚等领域[5]。细菌、酵母、放线菌等多种微生物资源中可以获得果胶酶[6-9]。酵母主要产酸性果胶酶，而细菌中主要是芽孢杆菌属的菌种产碱性果胶酶[10-11]。果胶酶作为重要的工业酶之一，在生物技术领域有相当可观的应用价值，其应用范围包括纺织加工、植物韧皮纤维的脱胶、果胶污水的处理、造纸业、咖啡和茶叶的发酵等工业领域[5]。

本实验对从新疆石河子一处碱性废水中分离得到的菌株XJU-8用形态学、生理生化及分子遗传学的方法进行多相鉴定，并对该菌株分泌的碱性果胶酶的酶学特性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

菌株XJU-8是从新疆石河子市一处污水厂的水样中分离得到。

果胶琼脂培养基：果胶0.5g、酵浸粉0.5g、KH2PO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂2g、pH10，蒸馏水定容至100mL；产果胶酶发酵培养基：果胶粉1g、酵母膏0.5g、NH4SO40.2g、K2HPO40.2g、MgSO40.2g、FeSO40.0001g、NaCl 0.03g，pH10，用蒸馏水定容至100mL。

EDTA-2Na、Tris、十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)、溴化乙锭(EB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、琼脂糖(Agarose) 上海Sangon公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

170-6701PCR仪、Gel Doc XR 170-8170凝胶成像仪美国伯乐公司；DYCP-31D水平电泳仪 北京六一仪器厂；GoldS54T紫外-可见分光光度计 上海棱光技术有限公司。

1.3 菌株的筛选

从碱性污水中所采集的样品在0.9% NaCl溶液中稀释。涂布到果胶琼脂培养基上，在37℃培养3d获得菌落。在单菌落周围加入几滴1% CTAB，静置10min，若有透明圈产生则为碱性果胶酶产生菌[12]。根据透明圈直径和透明度，菌株XJU-8被认为是碱性果胶酶产生菌。该菌株保藏于中国典型菌株保藏中心，保藏号为CCTCC AB 207169。

1.4 菌株的生理及形态学特性

用光学显微镜和透射电子显微镜进行细胞形态观察。表型特征检测实验参照文献[13-14]进行。

1.5 16S rDNA 扩增及序列分析

基因组DNA的提取与纯化根据Saito等[15]的方法进行。所用的引物是16S rDNA PCR通用正向引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和通用反向引物1492R (5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)[16]。测定的碱基序列用MEGA软件(可从http://www.megasoftware.net/MEGA3.1获得)拼接[17]。菌株的16S rDNA 基因序列提交到GenBank(注册号：EF643510)。

为了根据同源程度初步确定菌株XJU-8的分类学地位，采用ClustralXversion1.8进行多序列比对后，用邻位相连法(Neighbor-Joining)构建分子系统进化树，应用自展法(Bootstrap)检测系统树，循环1000次，绘制系统进化树。

1.6 基因组G+C含量测定

根据Tamaoka等[18]所描述的方法进行基因组G+C含量测定。

1.7 碱性果胶酶活力测定

1.7.1 粗酶液的制备

将50mL发酵培养基用0.5mL过夜培养菌液接种，最终OD600nm为0.6 ，在37℃培养72h，7000×g 离心10min，取上清液用做酶活性分析。

1.7.2 酶活力测定

采用3,5 - 二硝基水杨酸(DNS)法测定酶活力[19]。取0.4g/100mL果胶溶液1mL，加入1mL粗酶液，50℃水浴反应30min，取出煮沸5min，最终产物加入2.0mL DNS试剂，沸水浴加热2min，冷却后定容至25mL。取经加热煮沸10min 的失活酶液代替原酶液作空白对照。于520nm 波长处测光密度OD520nm。酶活力单位定义为每小时每毫升酶液由底物产生1mg还原糖(以半乳糖醛酸计)所需的酶量。每个实验重复做3次，求得其平均值。

1.7.3 pH值对酶活性和稳定性的影响

用不同的pH值(3.0～13.0)缓冲液配制底物，底物为质量浓度0.4g/100mL果胶溶液，加入1mL粗酶液，将不同的pH值反应体系置于50℃反应30min，测定酶活力。所用缓冲液(0.2mol/L)有：Na2HPO4-磷酸柠檬酸缓冲液(pH3.0～8.0)、氨基乙酸-NaOH缓冲液(pH9.0～10.0)、Na2HPO4-NaOH缓冲液(pH11.0)和KCl-NaOH 缓冲液(pH12.0～13.0)。为了检测果胶酶的pH值稳定性，酶在不同缓冲液中处理1h。酶活力按照1.7.2节方法测定，以最大酶活力为100%，计算相对酶活力。

1.7.4 温度对酶活性和稳定性的影响

底物为0.4g/100mL果胶溶液，加入1mL粗酶液，温度在30～90℃、pH10.0(0.2mol/L 氨基乙酸-NaOH缓冲液)条件下水浴反应，30min后测定酶活力。40、50、60℃条件下保温1h后，以未经保温处理的酶液为对照，每隔20min测定酶活力。以最大酶活力为100%，计算相对酶活力。

1.7.5 不同金属离子对碱性果胶酶活性的影响

底物为0.4g/100mL果胶溶液，加入1mL粗酶液，分别向酶与底物混合液中加入不同的金属离子，使其最终浓度为5mmol/L，测定其酶活力，以不加金属离子的酶活力为100%，计算相对酶活力。采用的试剂有：CaCl2·2H2O、FeCl3、CoCl2、ZnSO4·7H2O、CuSO4、HgCl2。

2 结果与分析

2.1 形态及生理生化特征

在果胶琼脂培养基上筛选的众多菌落中，菌株XJU-8形成的透明圈直径最大，透明度最好(图1)。这一结果显示该分离菌株是一株良好的果胶酶生产菌，并且在果胶琼脂培养基上能向胞外分泌果胶酶。菌株XJU-8为革兰氏阳性、杆状、好氧、无运动性、有芽孢的嗜碱菌。在透射电子显微镜下细胞为杆状((0.7～0.9)μm×(2.0～4.8)μm)， 没有鞭毛(图2)。该细菌拥有比较宽的pH值耐受范围(pH5.0～13.0)，最适pH值为10.5，是一个极端耐碱的菌株。它的生长温度范围是10～60℃，最适温度是37℃，对NaCl 耐性高达15%。

图1 初筛菌株在筛选平板上形成的透明圈Fig.1 Clear halos on screening plate formed by priliminarily screened strain

XJU-8和模式菌株B. claussi GMBAE 42[20]的表型和化学分类学特征见表1。XJU-8显示的极其有限的不同点如下： 能在50～60℃的温度条件和pH5.0～13.0的范围内生长繁衍，而且能水解Tween-40、Tween-60，没有氧化酶活性，并且不能利用柠檬酸盐作为碳源。这两株菌都可以水解干酪素和淀粉，不能水解Tween-20、Tween-80、精氨酸、赖氨酸、尿素等；在形态及生理生化特征上显示出很高的一致性。

图2 透射电子显微镜下的Bacillus claussi XJU-8Fig.2 Transmission electron micrograph of Bacillus claussi XJU-8

表1 菌株B.claussi XJU-8和B.claussi GMBAE 42的形态及生理生化特征Table 1 Morphological, physiological and biochemical characteristics of B. claussi XJU-8 and B. claussi GMBAE 42

2.2 16S rDNA 序列分析及G+C含量

对XJU-8 16S rDNA 序列进行测序获得1401nt的碱基序列(GenBank 注册号：EF643510)。序列比对结果表明，该菌株与Bacillus clausii的DNA序列相似率最高，高达99%以上。利用MEGA3.1软件对芽孢杆菌属的20株菌构建系统进化树，结果见图 3。XJU-8与其他B.claussi菌株紧密的聚集在同一个分支上，而且靴带值为100%。XJU-8的G+C含量为43.67%，与B. clausii的DNA G+C含量的变异范围(42.8～45.5mol %)吻合。基于上述形态及生理生化特征，16S rDNA 相似率，系统进化分析和G+C含量的结果，将新分离到的细菌精确鉴定为Bacillus clausii XJU-8。

图3 利用16S rDNA同源序列和邻接法构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis (Kimura 2-parameter model) and 16S RNA sequences

2.3 果胶酶活性

2.3.1 最适反应温度及稳定性

如图4所示，该果胶酶的最适温度为50℃，在反应温度低于50℃时随着温度升高酶活力增加，当高于50℃时随着温度升高酶活力迅速下降。在同样恒定的温度条件下，该果胶酶的活性表现较为稳定。

图4 温度对果胶酶活性(a)和稳定性(b)的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of alkaline pectinase

2.3.2 最适pH值和酸碱稳定性

图5 pH值对果胶酶活性pH(a)和稳定性(b)的影响Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of alkaline pectinase

由图5a可见，50℃条件下，果胶酶在pH3.0～13.0范围内均有活性，酸性条件下酶活性很低，pH值高于7时，酶活力明显上升，最适pH值为10，pH值高于12时酶活性急剧下降。由图5b可见，果胶酶活力在pH9～12能保持较高稳定性，在此pH值条件下处理1h，XJU-8 产生的果胶酶的酶活力仍能保持在80%以上，充分的显示该酶在强碱性条件下具有较高的稳定性。

2.3.3 不同金属离子对酶活性的影响

表2 不同金属离子对酶活性的影响Table 2 Effects of metal ions on the activity of alkaline pectinase

由表 2 可见，Fe3+、Co2+、Zn2+、Cu2+和 Hg2+离子均可对酶的活性产生抑制作用，其中Hg2+的抑制作用最为显著，可使酶的活力降低到原始活力的23.13%。Ca2+具有增大果胶酶活力的作用，可使酶的活力提高到原始活力的114.76%。

3 结 论

菌株XJU-8 在果胶培养基上生长而且能向胞外产生果胶酶。通过形态观察、生理生化检测、16S rDNA序列同源性、系统进化树分析和G+C含量的测定分析，本实验将新分离到的细菌XJU-8鉴定为Bacillus clausii XJU-8(EF643510，CCTCC AB 207169)。菌株 XJU-8 有很广阔的pH值(5.0～13.0)生长范围，它的最高pH值耐受值为13.0，极可能成为其他碱性酶类潜在的提供者。菌株XJU-8 产生的果胶酶最适反应温度为50℃，略高于以前所报道过的菌株Bacillus sp. WSHB04202(45℃)[21]，但是比B. subtilis(65℃)[22]和B. stearothermophilus(70℃)低。该酶的耐碱范围比以前所报道过的Bacillus sp.WSHB04202 (pH9.4)[21]，Bacillus stearothermophillus(pH9.0)[23]和B. subtilis(pH9.0)[23]都高，此菌株所产生的碱性果胶酶耐碱特性突出；在碱性(pH9～12)环境中比较稳定，而且在此条件处理1h仍然能保持80%以上的酶活性。Ca2+能使酶活性提高14.76%，可以看作是催化剂。菌株Bacillus clausii XJU-8及其碱性果胶酶在纺织工业、植物纤维的处理、咖啡和茶的发酵、油的提取、污染果胶污水的处理等工业生产应用领域具有潜在的应用前景。

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Isolation and Identification of Bacillus claussi XJU-8 and Enzymatic Properties of Its Slkaline Pectinase

Gulsumay HABIBULLA1，Ghenijan OSMAN1，Muhtar ABDUKERIM1,*，Shirenay PULAT2，Zilaygul MIJIT1，

ZHAO Jian1，Erkin RAHMAN1
(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University,830046, China；2. College of Life Science and Chemistry, Xinjiang Normal University,830054, China)

A bacterial strain designated as XJU-8 was isolated from alkaline sewage samples from Shihezi city, Xinjiang. This bacterial strain was a gram-positive, spore-forming, aerobic bacillus. It could grow in LB medium with a broad range of pH(5.0 － 13.0). The optimal growth conditions for this bacterial strain were 37 ℃ and pH 10.5. Its tolerance to NaCl was up to 15%. The 16S rRNA gene sequence analysis showed that the strain XJU-8 was highly related to B. claussi with 99% similarity.The G+C content in its genomic DNA was 43.67%. The strain XJU-8 was confirmed as B. claussi by comparing its physiological,biochemical and genetic characteristics with those of B. claussi GMBAE 42. Due to its excellent pH tolerance and several phenotypic characteristics, this strain was further confirmed and classified as a new member of B. claussi species. This strain also could produce an extracellular alkaline pectinase with the maximum enzyme activity at 50 ℃ and pH 10.0. More than 80% activity of this alkaline pectinase was remained at pH value ranging from 9.0 to 12.0. The activity of the alkaline pectinase could be enhanced in the presence of Ca2+. These properties demonstrated that this enzyme might be suitable for paper-making, coffee and tea fermentation, textile industries and other industrial applications.

Bacillus claussi；16S rDNA；phylogenetic analysis；alkaline pectinase

Q93.331

A

1002-6630(2011)05-0182-05

2010-04-20

新疆维吾尔自治区科技支疆项目(201091236)；科技部教学实验用微生物菌种资源子项目(2005DKA21208-9)；

新疆特殊环境实验室开放课题(XJYS0203-2010-5)

古丽斯玛依·艾拜都拉(1963—)，女，副教授，硕士，研究方向为资源微生物。E-mail：gulsimay2005@sina.com

*通信作者：木合塔·阿不都克里木(1962—)，男，副教授，学士，研究方向为微生物遗传。E-mail：muhtar97@sina.com