陈 静，陈小娥*，方旭波，余 辉

(浙江海洋学院食品与药学学院、医学院，浙江 舟山 316000)

响应面法优化Bacillus thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶

陈 静，陈小娥*，方旭波，余 辉

(浙江海洋学院食品与药学学院、医学院，浙江 舟山 316000)

目前，利用壳聚糖酶降解壳聚糖已成为生产功能性壳寡糖的首选途径。本研究在单因素试验的基础上，通过响应面法结合中心组合设计优化了Bacillus thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶的培养条件。结果表明：当虾壳粉质量浓度为44.96g/L、(NH4)2SO4质量浓度为1.48g/L、pH值为6.78时，B. thuringiensis ZJOU-010的壳聚糖酶活力达到4.25U/mL。优化后获得的实验值与模型的预测值(4.16U/mL)基本相符，且较优化前的酶活力(3.59U/mL)提高了18.47%。研究表明，利用生物催化技术以虾加工企业的副产物——虾壳粉为唯一碳源和氮源生产壳寡糖是可行的。

壳寡糖；虾壳粉；壳聚糖酶；优化；响应面

壳聚糖(chitosan)又称甲壳胺，它是自然界唯一的天然阳离子高聚物，也是自然界最丰富的多糖之一，在食品、化妆品、医药等领域有广泛的用途[1-3]。然而，由于壳聚糖分子质量大、水溶性差、在人体内不易吸收，因而其应用难以得到进一步拓展。近几年的研究发现，壳聚糖降解后获得的壳寡糖不仅具有水溶性好、保湿性好、易吸收等优点，还有抗肿瘤，抗细菌、真菌，免疫激活等独特的生理功能，应用前景十分广阔，因而有关壳寡糖的制备方法日益成为研究热点[4]。目前降解壳聚糖的方法主要有酸解法和酶解法，其中酸解法得率低，产物纯化难，降解产物聚合度小，且对环境污染严重；酶解法以产率高、反应条件温和且易控制、产物安全性好及所得低聚物聚合度适中等优点而备受青睐。因此，利用壳聚糖酶降解壳聚糖已成为功能性壳寡糖生产的首选途径[5-6]。

壳聚糖酶主要分布于细菌和真菌体内，但是迄今报道的微生物大多是以可溶性壳聚糖为唯一碳源[7-8]。在前期的研究工作中，笔者实验室筛选到一株产壳聚糖酶的菌株Bacillus thuringiensis ZJOU-010，这是该种内发现能以虾壳粉(shrimp shell powder，SSP)为唯一碳源和氮源产壳聚糖酶的菌株。该工艺的优势在于，以虾加工过程中产生的副产物SSP为原料进行资源化利用，变废为宝，具有较高的经济效益，同时还能减少环境污染[9]。

然而，目前以虾壳粉为基质合成的壳聚糖酶活力较低，使得壳寡糖的酶法生产工艺难以进行工业化应用，因此提高壳聚糖酶活力具有重要的研究和应用价值。众所周知，产酶培养基的优化是提高微生物源酶活力的重要方式，其最常见的策略是单次单因素(one variable at a time)法。但是该法在考察的因素较多时，需要较多的实验次数和较长的实验周期，而且不能考察各因素间的交互作用[10]。为了弥补单次单因素法的缺陷，本实验采用中心组合试验设计和响应面法优化B. thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶的培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis ZJOU-010)由本实验室从水产加工企业周围土壤中筛选得到，其16S rRNA的基因序列在Gene Bank 的登录号为GU384894。虾壳由浙江兴业集团有限公司馈赠。将经自来水冲洗并干燥后的虾壳用超微粉碎机加工成粉状，作为微生物生产壳聚糖酶的碳源和氮源。

壳聚糖(脱乙酰度83%) 浙江天宝壳聚糖有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004电子分析天平 上海精密仪器仪表有限公司；HYG-11回转式恒温调速摇瓶柜 上海新星自动化控制设备成套厂；UV-754型紫外-可见分光光度计 上海分析仪器厂；电热恒温培养箱 上海跃进医疗器材厂；X-22 Centrifuge高速离心机 美国Beckman Coulter公司。

1.3 培养基

斜面培养基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、琼脂15；种子培养基(g/L)：SSP 20、(NH4)2SO43、K2HPO40.2、MgSO40.3，pH7.0；产酶培养基(g/L)：SSP 30、(NH4)2SO41、K2HPO40.2、MgSO40.3，pH7.0。

1.4 培养条件

种子培养：从培养好的斜面中挑取一环菌种接入装有40mL种子培养基的250mL三角瓶中，32℃、160r/min的摇床上培养24h。

产酶培养：培养24h后的种子液，以体积分数3%的接种量接种至产酶培养基中，然后在32℃、160r/min的摇床上培养48h。

1.5 酶活力的测定

将发酵液于10000×g离心10min，取上清液0.5mL，加入1mL 0.5g/100mL的壳聚糖溶液(pH5.0)和0.2mol/L的HAc-NaAc缓冲液(pH5.0)3.5mL。在40℃恒温水浴锅中反应15min，立即加入2mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，混匀，置沸水浴中反应5min，冷却后定容至25mL，离心去除未水解的壳聚糖，取上清液测OD510nm值[11]。等量煮沸灭活的发酵液作为空白对照。壳聚糖酶酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟水解底物形成相当于1μmol 氨基葡萄糖时所用酶量为1个酶活力单位(U)。

1.6 单因素试验

为了选择对Bacillus thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶能力影响较大的因素，本研究分别对SSP质量浓度、(NH4)2SO4质量浓度、Ca2+浓度、Mg2+浓度、培养基初始pH值、接种量、摇瓶装液量、摇床转速及温度等参数进行单因素优化试验。根据试验结果，选择3个关键因素用于后续响应面分析，并粗略估计响应面试验的中心试验点和各因素的取值区间。

1.7 响应面试验设计

响应面分析法是数学方法和统计技术相结合的一种分析方法，中心旋转组合设计是响应面法常用的一种试验设计方法[12]，本试验选择SSP质量浓度、(NH4)2SO4质量浓度和培养基初始pH值3个因素设计正交旋转回归试验，每个因素选3个水平，以壳聚糖酶活力为响应值作响应面设计，对培养条件进行优化，总共需20个试验，其中6个是中心点的重复试验。用响应面试验结果建立多项式回归模型，表达式为：

式中：X1、X2、X3分别为SSP质量浓度、(NH4)2SO4质量浓度和培养基初始pH值的编码值，Y为预测值即发酵液中壳聚糖酶活力；b0为常数项；b1、b2、b3为一次项回归系数；b12、b13、b23为互作相回归系数；b11、b22、b33为二次项回归系数。通过Design Expert软件对试验结果进行回归分析，其中回归系数的显著性由F(Fischer)检验，方程的拟合程度由R2决定[13]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

通过对诸多产酶条件的单因素试验，结果发现与Ca2+浓度、Mg2+浓度、接种量、摇瓶装液量、摇床转速及温度等因素相比，SSP质量浓度、(NH4)2SO4质量浓度与pH值对产壳聚糖酶的影响更为显著。由于篇幅所限，本实验重点对上述3个因素的产酶影响进行分析。

2.1.1 SSP质量浓度对壳聚糖酶活力的影响

图1 SSP质量浓度对壳聚糖酶活力的影响Fig.1 Effect of SSP concentration on chitosanase activity

由图1可见，当SSP质量浓度从10g/L增加至30g/L时，壳聚糖酶活力不断升高，这归因于可利用的碳源和氮源逐渐增多。但是，当SSP质量浓度继续增加时，酶活力开始逐渐降低。究其原因，可能是由于过量的营养物质导致培养基黏度增大而使菌体传质不利。因此，本实验较适宜的SSP质量浓度为30g/L。

2.1.2 (NH4)2SO4质量浓度对壳聚糖酶活力的影响

氮是组成微生物细胞蛋白质、酶和核酸的主要元素之一。虽然SSP本身含有氮源，在培养基中既能充当碳源，又能充当氮源，但是由图2可知，与不加额外氮源相比，加入一定量的(NH4)2SO4能提高壳聚糖酶活力。这可能是由于(NH4)2SO4更容易被微生物利用而促进细胞生长。当(NH4)2SO4添加量为1.0g/L时，酶活力达到最大值；其后再增加(NH4)2SO4质量浓度，酶活力不再增加，反而呈下降趋势，导致这一现象的可能原因有两个：1)(NH4)2SO4作为一种无机氮源，其添加量决定了培养基的碳氮比，进而影响菌体生长与产酶，当增加(NH4)2SO4质量浓度时，菌体的生物量增加，而菌体生长过于旺盛并不利于壳聚糖酶的积累；2)(NH4)2SO4是一种强酸弱碱盐，在发酵的后期，NH4+被利用后，培养基pH值明显下降从而影响产酶。

图2 (NH4)2SO4质量浓度对壳聚糖酶活力的影响Fig.2 Effect of (NH4)2SO4 concentration on chitosanase activity

2.1.3 产酶培养基初始pH值对酶活力的影响

图3 产酶培养基初始pH值对壳聚糖酶活力的影响Fig.3 Effect of initial pH on chitosanase activity

由图3可见，不同初始pH值的培养基对发酵产壳聚糖酶有显著影响。众所周知，培养基的pH值影响细胞膜表面带电基团的解离及其微观结构，进而影响营养物质的吸收，导致微生物的生长和代谢发生变化；此外，壳聚糖酶是一种胞外酶，pH值通过影响细胞膜的通透性而决定细胞分泌胞外酶的能力。值得一提的是，迄今多数文献报道的较适宜的产壳聚糖酶的pH值为5.0～6.5[14-15]，而本研究的B. thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶的pH值以7.0为宜(图3)。究其原因，前者的微生物以壳聚糖作为碳源，当培养基pH值大于6.5时，壳聚糖开始出现沉淀，因而微生物难以利用其生长致使产酶受到严重抑制；后者的B. thuringiensis ZJOU-010以SSP为碳源，SSP溶解度并不随培养基pH值的变化而产生显著差异，微生物于pH7.0生长良好。

2.2 中心组合设计(CCD)及响应面法优化B. thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶的培养条件

2.2.1 响应面分析因素水平的选取

根据中心组合试验设计原理，综合2.1节单因素试验结果，设计SSP质量浓度、(NH4)2SO4质量浓度和pH值3个因素进行正交旋转回归试验，每个因素选3个水平，以壳聚糖酶活力为响应值作响应面设计，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels in response surface design

2.2.2 响应面分析试验设计方案

以SSP质量浓度、(NH4)2SO4质量浓度和pH值为自变量，以壳聚糖酶活力为响应值(Y)，进行响应面分析试验。试验方案及结果见表2。

表2 响应面中心组合试验设计安排及结果Table 2 Response surface central composite design and corresponding results

2.2.3 多元二次响应面回归模型的建立与分析

对表2试验结果通过Design expert软件程序进行二次回归响应面分析，建立多元二次响应面回归模型：

由表3可见，该回归模型高度显著(P＜0.0001)，失拟项(P=0.3079)不显著，说明本试验在整个回归区域的拟合情况良好，可用该模型代替试验真实点对试验结果进行分析[16]。回归模型各项的方差分析结果还表明，一次项、二次项都有较显著影响，所以响应值的变化相当复杂，各个具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。回归模型中作用极显著的是X1、X2、X1X2、和。因此，在一定范围内可调节SSP质量浓度、(NH4)2SO4质量浓度和pH值的关系，使壳聚糖酶活力达到所需水平。

影响壳聚糖酶活力的各因素按显著性排序依次为：(NH4)2SO4质量浓度＞SSP质量浓度＞pH值。方程复相关系数的平方(R2)值为0.9618，说明96.18%的试验数据可由此方程解释，模型拟合程度很好。

模型的调整决定系数R2adj值为0.9275，说明该方程的应变量与全体自变量间线性关系显著，响应值的变化有92.75%来源于所选自变量；模型的变异系数为6.4%，说明模型的精密度良好。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the developed regression equation

2.2.4 各因素间交互作用对壳聚糖酶活力的响应面分析

根据回归方程，绘出响应面分析图及等高线图，见图4～6。每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用，此时第3个变量为一恒定值(零水平值)。

图4 SSP质量浓度和(NH4)2SO4质量浓度对壳聚糖酶活力的影响Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between SSP concentration and (NH4)2SO4 concentration on chitosanase activity

由图4可见，硫酸铵质量浓度(X1)与SSP质量浓度(X2)交互作用极显著，而且随着两者质量浓度的增加，壳聚糖酶活力逐渐增大；当SSP质量浓度和硫酸铵质量浓度分别为44.85g/L和1.48g/L时，壳聚糖酶活力达到最大值(4.15U/mL)。

图5 (NH4)2SO4质量浓度和pH值对壳聚糖酶活力的影响Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between (NH4)2SO4 concentration and pH on chitosanase activity

从图5的圆形等高线可知，pH值和硫酸铵质量浓度的交互作用不显著，最优点接近于pH7.0和硫酸铵质量浓度1.50g/L。同时，从等高线图可看出，酶活力对硫酸铵质量浓度变化比对pH值的变化稍为敏感。

从图6可以看出，SSP质量浓度(X1)和pH值(X3)的交互作用较显著，当固定pH值在某一值时，随SSP质量浓度的增加，壳聚糖酶活力也增加，并且其值呈直线的趋势增加。当固定SSP质量浓度在某一值时，随pH值的增加，壳聚糖酶活力先增加后减小。当SSP质量浓度为44.99g/L，pH6.79时，壳聚糖酶活力最大(3.62U/mL)。

图6 SSP质量浓度和pH值对壳聚糖酶活力的影响Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between SSP concentration and pH on chitosanase activity

2.3 验证实验

利用Design expert 7.1.16的数值特性，各因素的最大和最小取值及壳聚糖酶活力的取值范围见表5。通过软件得出，在SSP质量浓度为44.96g/L、(NH4)2SO4质量浓度为1.48g/L和pH6.78的条件下，最大壳聚糖酶活力预测值为4.16U/mL。为验证回归模型的可靠性，在响应面分析法求得的最佳条件下进行了3次验证实验，实际测得的酶活力为4.25U/mL，发现实测值与回归方程预测值吻合良好，由此可见，用该回归模型优化B. thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶的培养条件是可行的，具有实用价值。此外，与响应面优化前的最大酶活力(3.59U/mL)相比，提高了18.47%。

表5 最大酶活力的优化范围Table 5 Optimal range to achieve the maximum chitosanase activity

3 讨论与结论

响应面法克服了正交设计只能处理离散的水平值而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷。响应面分析方法是研究几种因素间交互作用的回归分析方法。将该方法用于壳聚糖酶产生菌B.thuringiensis ZJOU-010培养条件的优化，求得的回归方程精度高；可以准确找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，是比较理想的方法。该方法通过响应面图直观分析了各因素对壳聚糖酶活力的影响，以及各因素之间对酶活力的交互作用。应用响应面设计法优化出最佳培养条件为：SSP质量浓度44.96g/L、(NH4)2SO4质量浓度1.48g/L和pH6.78，在此条件下壳聚糖酶活力达4.25U/mL，与优化前的酶活力(3.59U/mL)相比，提高了18.47%。本研究证明，以SSP为唯一碳源和氮源生产壳寡糖是切实可行的，从可持续发展的角度看，这一生产过程既能减少环境污染又具备经济效益，具有广阔的应用前景，尤其随着近年来水产企业副产物日益增多，这一工艺更具竞争力。然而，今后的工作重心还需放在以B. thuringiensis ZJOU-010所产壳聚糖酶为催化剂，以海洋废弃物为原料生产功能性壳寡糖的工业化生产上，真正做到变废为宝。

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Optimization of Chitosanase Production from Bacillus thuringiensis ZJOU-010 by Response Surface Methodology

CHEN Jing，CHEN Xiao-e*，FANG Xu-bo，YU Hui
(College of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China)

Chitooligosaccharides exhibit a broad range of potential applications in the fields of biomedicine, pharmaceuticals,food, cosmetics and agriculture. In the present study, based on the results from single factor tests, response surface methodology(RSM) combined with central composite design was used to optimize cultivation conditions of Bacillus thuringiensis ZJOU-010 for producing chitosanase. The optimal conditions were achieved to be shrimp shell powder (SSP) concentration of 44.96 g/L,(NH4)2SO4 concentration of 1.48 g/L, and pH of 6.78. Under the optimal conditions, the chitosanase activity from Bacillus thuringiensis ZJOU-010 was 4.25 U/mL. The obtained value of chitosanase activity was in good agreement with the predicted value (4.16 U/mL). Meanwhile, 18.47% improvement on chitosanase activity after the optimal cultivation was achieved, when compared with the chitosanase activity of 3.59 U/mL before optimization. These results indicated that oligosaccharides could be produced using shrimp processing by-products as the carbon and nitrogen sources.

chitooligosaccharides；shrimp shell powder；chitosanase；optimization；response surface methodology

TS210.1

A

1002-6630(2011)05-0176-06

2010-05-01

浙江省自然科学基金项目(Y305119)；浙江省优先主题农业项目(2008C12029)；浙江海洋学院科研启动基金项目

陈静(1979—)，女，讲师，博士，研究方向为海洋生物资源综合利用。E-mail：chenjing1979@126.com

*通信作者：陈小娥(1969—)，女，副教授，博士，研究方向为海洋生物资源综合利用及功能性食品。E-mail：xiaoechen@163.com