万利秀，肖更生*，徐玉娟，蒋爱民，陈卫东，陈于陇，吴继军

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642)

柑橘皮黄酮纯化前后抗氧化性比较研究

万利秀1,2，肖更生1,*，徐玉娟1，蒋爱民2，陈卫东1，陈于陇1，吴继军1

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642)

比较9个品种柑橘皮黄酮对DPPH自由基的清除作用和对Fe3+的还原力，并研究大孔树脂纯化对其抗氧化活性的影响。结果表明：不同品种柑橘皮黄酮的还原力和对DPPH自由基的清除作用均存在显著差异(P＜0.05)，无论是纯化前还是纯化后，还原力和对DPPH自由基的清除作用最强的品种都是南丰橘，纯化前后对Fe3+还原力的IC50分别为(0.166±0.002)mg/mL、(45.69±1.38) μg/mL，对DPPH自由基清除作用的IC50分别为(0.38±0.03)、(0.086±0.003)mg/mL。而福建蜜柑还原力和对DPPH自由基的清除作用最弱，纯化前后对Fe3+还原力的IC50分别为(0.306±0.003)mg/mL、(97.80±1.06) μg/mL，对DPPH自由基清除作用的IC50分别为(0.88±0.02)、(0.281±0.003)mg/mL。纯化后柑橘皮黄酮的抗氧化性显著提高(P＜0.05)；新会陈皮黄酮纯化后对DPPH自由基的清除作用是纯化前的8.3倍，而江西柳橙黄酮纯化后对DPPH自由基的清除作用为纯化前的2.6倍；江西脐橙纯化后还原力为纯化前的4.5倍，江西柳橙纯化后还原力为纯化前的2.8倍。

柑橘；柑橘皮；黄酮；纯化；抗氧化

柑橘皮中含有丰富的黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎、抗动脉硬化、抗癌、抑菌、降血脂等[1-6]功效。我国是橘类生产大国，然而，用于加工的柑橘还不到10%，而且每年占柑橘加工量50%的皮渣被废弃。不仅浪费了资源，而且造成了巨大的环境污染[7]。广东是我国柑橘的主要产地之一，许多名优特色品种如廉江红江橙、梅县金柚、四会沙糖橘、德庆贡柑、平远脐橙、潮州蕉柑、阳春马水橘等产品都具备优良的品质，深受消费者的喜爱。但广东柑橘多以鲜销为主，加工业比较落后，因此，大力发展柑橘综合加工业，充分、合理、综合利用柑橘资源，对促进柑橘产业可持续发展具有十分重要的意义[8]。目前，大孔树脂被广泛用于柑橘皮黄酮的纯化，但纯化对黄酮抗氧化性的影响的研究主要集中于单一品种，而综合考察大孔树脂纯化对不同柑橘品种黄酮的抗氧化性的影响的研究并不多。因此，本研究以华南地区具有代表性的9个柑橘品种为研究对象，分析不同品种柑橘皮黄酮纯化前和纯化后的抗氧化活性差异，为其在食品和化妆品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

德庆皇帝柑、福建蜜柑、江西柳橙、江西脐橙、南方蜜橘、南丰橘、四会沙糖橘、江西蜜柑、新会陈皮橘均购于研究所附近农贸市场。

芦丁、橙皮苷、柚皮苷 美国Sigma公司；川陈皮素、橘皮素、4＇-OH-5,6,7,8-四甲基黄酮 实验室制备；二苯代苦味酰基(DPPH)自由基 日本东京化成工业株式会社；X-5大孔树脂 南开大学化工厂；乙腈(色谱纯) 德国默克公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏试验设备有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；UV-1800型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Agilent 1100系列高效液相色谱仪(由四元低压泵、柱温箱、二级管阵列检测器、自动进样器及Chemstation工作站等组成，色谱柱为ZORBAX C18SB反向色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)) 美国Agilent 公司；DG180型中药材粉碎机 浙江省瑞安市春海药材器械厂。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

不同品种的柑橘洗涤后剥皮，于50℃烘箱中烘干至恒质量，粉碎，60目过筛得柑橘皮粉末，备用。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线的绘制在苏东林[9]的方法基础上稍作修改，具体方法为：精确称取干燥至恒质量的芦丁标准品11.2mg于烧杯中，加入30%的乙醇溶解后移至100mL容量瓶中，用30%的乙醇定容，即得0.112mg/mL芦丁标准溶液。分别取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于7支试管中，加30%的乙醇至5mL，加5%亚硝酸钠0.4mL，摇匀，静置6min；加10%硝酸铝0.4mL，摇匀，静置6min；加4%氢氧化钠4.0mL，30%乙醇定容至10.0mL，摇匀，静置15min，在510nm波长处比色测定。以标准品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线：y=11.933x－0.0011(R2=0.9999)。

1.3.3 总黄酮含量的测定

取1mL提取液按1.3.2节的方法测定510nm波长处的吸光度，对照标准曲线，按式(1)计算柑橘皮中总黄酮含量。

式中：ρ为查标准曲线所得黄酮质量浓度/(mg/mL)；m为样品质量/g。

1.3.4 柑橘皮黄酮的纯化

柑橘皮黄酮的纯化方法参考陈复生等[10]的方法稍作修改，准确称取柑橘皮粉200g，按料液比1:20加入95%乙醇于室温浸泡过夜后，抽滤，减压浓缩至无醇味，用石油醚萃取除去脂溶性成分，再用X-5大孔树脂纯化。纯化工艺如下：上样液质量浓度0.57～1.14mg/mL，吸附和解吸速率均为1mL/min，解吸剂为50%乙醇。上样后，先用蒸馏水洗至流出液无色，再用50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥后得纯化后总黄酮样品，备用。

1.3.5 对DPPH自由基清除能力的测定

对DPPH自由基的清除能力的测定在Zhang等[11]的基础上稍做修改，准确称取DPPH标准品0.0039g，用无水乙醇溶解并定容至100mL，其溶液浓度为1×10-4mol/L。加样于具塞试管中，摇匀反应30min后，以3.5mL无水乙醇和0.5mL蒸馏水的混合液为参比，用紫外-可见分光光度计在517nm波长处分别测定吸光度。

式中：A样品是3.5mL DPPH和0.5mL黄酮提取液在517nm波长处的吸光度；A0是3.5mL DPPH和0.5mL无水乙醇在517nm波长处的吸光度。

1.3.6 对 Fe3+还原力的测定

参照Ardestani等[12]的方法，1mL提取液加入2.5mL磷酸缓冲液(pH6.6，0.2mol/L)及2.5mL质量分数1%的K3Fe(CN)6，于50℃水浴中反应20min后迅速冷却，并加入2.5mL质量分数10%的三氯乙酸(TCA)溶液，以3000 r/min 离心10min后取上清液2.5mL，并加入2.5mL蒸馏水及0.5mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，混合均匀，10min后，测定波长700nm处的吸光度。

1.3.7 高效液相色谱条件

ZORBAX C18SB反向色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为2%乙酸水溶液和乙腈，梯度洗脱：0～5min，乙腈为5%～10%；5～35min，乙腈为10%～50%；35～40min，乙腈为50%～80%；40～45min，乙腈为80%；45～55min，乙腈为80%～5%。流速1.0mL/min；检测波长为330nm；柱温为25℃，自动进样器温度为4℃，进样量20μL。

2 结果与分析

2.1 柑橘皮黄酮纯化前后对DPPH自由基的清除作用

图1 柑橘皮黄酮纯化前对DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activities of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels at varying concentrations

图2 柑橘皮黄酮纯化后对DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical scavenging activities of purified flavonoids from different varieties of citrus peels at varying concentrations

由图1、2可知，柑橘皮提取物对DPPH自由基的清除作用表现出明显的量效关系。以提取物质量浓度为横坐标，对DPPH自由基的清除率为纵坐标，用Excel软件处理数据得到18个线性方程，从而计算出不同品种柑橘皮黄酮对DPPH自由基的清除作用的IC50，并用SAS 8.1 Duncan 多重比较法得出各品种抗氧化作用的差异性，结果如表1、2所示。

由表1、2可知，纯化前，除福建蜜柑与江西脐橙；江西蜜柑、江西柳橙和四会沙糖橘之间不存在显著性差异外，不同品种柑橘皮黄酮对DPPH自由基的清除作用差异显著(P＜0.05)，南丰橘对DPPH自由基的清除作用的IC50最小，仅为(0.38±0.03)mg/mL，福建蜜柑对DPPH自由基的清除作用的IC50最大，为(0.88±0.02)mg/mL，是南丰橘的2.3倍，即南丰橘对DPPH自由基的清除作用是福建蜜柑的2.3倍；纯化后，除福建蜜柑和其他品种之间存在差异外，其他品种柑橘皮黄酮对DPPH自由基的清除作用均无明显差异；无论是纯化前还是纯化后，南丰橘黄酮对DPPH自由基的清除作用都最大，福建蜜柑黄酮最小。食物的抗氧化能力，主要取决于食物中的抗氧化物含量[13]。不同品种柑橘皮中黄酮含量不同，因此表现出来的抗氧化能力差别比较大。对于同一种柑橘品种，柑橘皮黄酮纯化前后对DPPH自由基的清除作用差异显著(P＜0.05)，新会陈皮黄酮纯化前对DPPH自由基的清除作用的IC50是纯化后的8.3倍，即纯化后新会陈皮黄酮对DPPH自由基的清除作用增加为纯化前的8.3倍；而江西柳橙黄酮纯化前对DPPH自由基的清除作用的IC50仅为纯化后的2.6倍，即纯化后江西柳橙黄酮对DPPH自由基的清除作用增加为纯化前的2.6倍。陆英等[14]比较了红薯叶黄酮纯化前后的抗氧化性差异，红薯叶黄酮粗提产品与纯化产品的IC50分别为3.06×10-2、3.58×10-3mg/mL，纯化产品清除DPPH自由基明显强于粗提产品，与本研究结果一致。大孔树脂吸附后可以除去初提物中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分，不仅增加了产品的稳定性，还可使药效成分高度富集，杂质少，从而抗氧化活性增强[15]。

表1 柑橘皮黄酮纯化前对DPPH自由基清除作用的IC50Table 1 IC50 for DPPH radical scavenging activity of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

表2 柑橘皮黄酮纯化后对DPPH自由基清除作用的IC50Table 2 IC50 for DPPH radical scavenging activity of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

2.2 柑橘皮黄酮纯化前后的高效液相色谱图

6种黄酮标准品及纯化前后黄酮溶液(1mg/mL)分别用1.3.7节方法进行测定，得到其液相色谱图如图3、4所示。

图3 9种柑橘品种柑橘皮中黄酮类化合物纯化前的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

图4 9种柑橘品种柑橘皮中黄酮类化合物纯化后的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

由图3可知，不同品种柑橘皮中，不仅黄酮含量不同，黄酮种类也存在差异。黄酮含量较高的品种有德庆皇帝柑、南丰橘、四会沙糖橘和新会陈皮；德庆皇帝苷中主要黄酮为川陈皮素和橘皮素，福建蜜柑中主要黄酮为柚皮苷，江西柳橙中主要黄酮为橙皮苷、柚皮苷、4＇-OH-5,6,7,8-四甲基黄酮和川陈皮素，江西脐橙中主要黄酮为橙皮苷、柚皮苷、4＇-OH-5,6,7,8-四甲基黄酮和川陈皮素，南方蜜橘中主要黄酮为橙皮苷、柚皮苷和川陈皮素，南丰橘中主要黄酮为川陈皮素和橘皮素，四会沙糖橘中主要黄酮为川陈皮素和橘皮素，江西蜜柑中主要黄酮为柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素，新会陈皮中主要黄酮为川陈皮素和橘皮素。

通过比较纯化前后柑橘皮黄酮的液相图3和图4可以看出，大孔树脂纯化后杂质少，有效成分高度富集，因此，用大孔树脂对柑橘皮黄酮进行纯化是提高产品纯度及其抗氧化性的有效途径之一。

2.3 柑橘皮黄酮纯化前后还原力

由图5、6可知，柑橘皮提取物还原力表现出明显的量效关系。以提取物质量浓度为横坐标，还原力为纵坐标，用Excel 软件处理数据得到18个线性方程，从而计算出不同品种柑橘皮黄酮对Fe3+的IC50，并用SAS 8.1 Duncan 多重比较法得出各品种抗氧化作用的差异性，结果如表3、4所示。

图5 柑橘皮黄酮纯化前还原力Fig.5 Reducing power of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

图6 柑橘皮黄酮纯化后还原力Fig.6 Reducing power of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

表3 柑橘皮黄酮纯化前对Fe3+的IC50Table 3 IC50 for reducing power of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

表4 柑橘皮黄酮纯化后对Fe3+的IC50Table 4 IC50 for reducing power of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

由表3、4可以看出，纯化前，除福建蜜柑和江西脐橙还原力与其他品种之间存在差异外，其他品种之间差异不显著；而纯化后，福建蜜柑和所有品种之间均存在显著差异(P＜0.05)；无论是纯化前还是纯化后，还原力最高的品种都是南丰橘，还原力最低的品种是福建蜜柑；黄酮纯化前后还原力也存在显著差异，江西脐橙纯化前还原力的IC50为纯化后的4.5倍，即纯化后江西脐橙黄酮还原力为纯化前的4.5倍，江西柳橙还原力的IC50为纯化后的2.8倍，纯化后江西柳橙黄酮还原力为纯化前的2.8倍。

3 结 论

3.1 不同品种柑橘皮黄酮的抗氧化活性不同，无论是纯化前还是纯化后，抗氧化性最强的品种均为南丰橘，而抗氧化性最低的品种为福建蜜柑。

3.2 大孔树脂纯化前后黄酮的抗氧化性也存在差异，纯化后黄酮的抗氧化性明显高于纯化前, 新会陈皮黄酮纯化后对DPPH自由基的清除作用是纯化前的8.3倍，而江西柳橙黄酮纯化后对DPPH自由基的清除作用为纯化前的2.6倍；江西脐橙纯化后还原力为纯化前的4.5倍，江西柳橙纯化后还原力为纯化前的2.8倍。

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A Comparative Study of Antioxidant Activity of Flavonoids from Citrus Peel before and after Purification

WAN Li-xiu1,2，XIAO Geng-sheng1,*，XU Yu-juan1，JIANG Ai-min2，CHEN Wei-dong1，CHEN Yu-long1，WU Ji-jun1
(1. Sericulture and Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China；2. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study, DPPH radical scavenging activities and reducing powers of flavonoids from 9 different varieties of citrus peel were compared. Meanwhile, the effect of macroporous resin purification on these antioxidant activities was studied. The results indicated that both DPPH radical scavenging activities and reducing powers of flavonoids differed significantly among 9 varieties of citrus peel (P < 0.05). Both crude and purified flavonoids from Nanfeng citrus peel revealed the strongest DPPH radical scavenging activity and reducing power, with median inhibitory concentrations (IC50) of (0.38 ± 0.03) mg/mL and (0.086 ±0.003) mg/mL for scavenging DPPH radicals, respectively and reducing powers of for flavonoids from Nanfengju before and after purification were (0.166 ± 0.002) mg/mL and (45.69 ± 1.38)μg/mL, respectively. On the other hand, flavonoids from Fujian sweet mandarin peel revealed the weakest DPPH radical scavenging activity and reducing power. The IC50 values for DPPH radical scavenging activity of flavonids from Fujian sweet mandarin peel before and after purification were (0.88 ± 0.02) mg/mL and (0.281 ± 0.003) mg/mL, and those for reducing ferric ion before and after purification were (0.306±0.003) mg/mL and(97.80 ± 1.06)μg/mL, respectively. Therefore, macroporous resin purification could result in a significant enhancement in antioxidant activities of flavonoids from citrus peel. The DPPH radical scavenging activities of flavonoids from Xinhui mandarin peel and Jiangxi navel orange peel revealed 8.3- and 2.6-fold enhancement after purification, and the reducing powers of flavonoids from Jiangxi navel orange peel and Jiangxi Liucheng orange peel exhibited 4.5- and 2.8-fold increase after purification,respectively.

citrus；citrus peel；flavonoids；purification；antioxidation

O623.54

A

1002-6630(2011)05-0087-05

2010-05-21

广东省关键领域重点突破项目(2007A020901004)

万利秀(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail：mo_wlx2000@yahoo.com.cn

*通信作者：肖更生(1965—)，男，研究员，硕士，研究方向为农产品深加工。E-mail：gshxiao@yahoo.com.cn