李 斌，孟宪军*，薛 雪，吴 倩，李元甦，汪艳群

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

北五味子乙素清除自由基及体外抑菌作用的研究

李 斌，孟宪军*，薛 雪，吴 倩，李元甦，汪艳群

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

对五味子乙素进行清除自由基及体外抑菌实验。结果表明：五味子乙素对自由基的清除效果明显，其中对羟自由基清除作用大于相同质量浓度的VC，其半数清除质量浓度为0.2mg/mL；对超氧阴离子自由基清除作用小于VC，其半数清除质量浓度为0.24mg/mL。五味子乙素提取液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用，其中对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度为0.25mg/mL，对根霉、黑曲霉、南洋酵母无明显抑菌活性。

五味子；乙素；清除自由基；抑菌

五味子为木兰科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.) Baill)的果实，习称“北五味子”。《中华人民共和国药典》中规定其果实、种子、藤茎均可入药[1]。其广泛分布于我国东北部山区，它的干燥成熟果实为临床常用的滋补性中药，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效[2]。木脂素类成分是五味子的主要药用成分[3-5]，主要具有抗肿瘤、抗病毒、保肝、抗衰老等[6]作用。五味子乙素作为五味子木脂素的主要活性成分之一[7]，伴随着人们对木脂素的研究而备受关注。近年来研究表明，五味子乙素具有保肝、抗癌、抗溃疡等药理作用，已经被应用到医药、食品、化妆品等领域中[8-9]。但国内外目前对于五味子乙素单体的体外抗氧化研究多集中在体内组织抗氧化能力[10]，而对体外抗氧化能力研究的相关报道较少；关于五味子提取物抑菌作用研究，多在五味子总木脂素混合物的抑菌作用研究[11]，其中木脂素单体的抑菌作用和机理研究较少。

本实验采用将超临界萃取五味子粉末，液相色谱制备后的五味子乙素提取液进行清除自由基及抑菌作用的研究[12-16]，为开发北五味子深加工产品提供依据，也为五味子乙素的研发提供新的可利用资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

五味子，2009年10月采于辽宁省新宾县，由辽宁中医药大学赵百锁副教授鉴定为北五味子。

五味子乙素标准品(纯度≥98%) 上海同田生物科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸亚铁、邻菲罗琳、抗坏血酸、邻苯三酚、浓硫酸、浓盐酸、双氧水、无水乙醇、甲醇、三羟甲基氨基甲烷均为分析纯 沈阳化学试剂厂。

细菌：枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans)、沙门氏菌(Salmonella)；真菌：南洋酵母(Nanyang yeast)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus)。

培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。

1.2 仪器与设备

UV-1600型紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；电热恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；电子分析天平 上海天平仪器厂；Hzp-250型全温振荡培养箱 上海精宏实验设备有限公司；FT-IR200型傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo公司； 5890高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 五味子乙素提取液清除自由基研究

1.3.1.1 五味子乙素提取液清除羟自由基的测定

采用超临界CO2提取五味子粉末，在压力30MPa，温度40℃，粒度40目，时间2h条件下，得到五味子乙素的提取率为3.519mg/g，采用制备液相Symmetry C18色谱柱分离，以甲醇-水为流动相，配比70:30洗脱，收集31.2～32.4min五味子乙素提取液。稀释收集五味子乙素提取液，使五味子乙素的质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，另配制相同质量浓度梯度的抗坏血酸溶液作比较。

五味子乙素提取液结构鉴定：五味子乙素提取液进行红外光谱和HPLC测定，根据目标成分的峰面积的百分比得出其纯度。

参照Fenton反应体系及林砚淋等[17]的方法进行改进，依次加入反应液。反应体系置于37℃恒温水浴锅中，准确反应90min后，立即取出并迅速测定其在536nm波长处的吸光度(蒸馏水作参比，便于提高精度，测3次，取平均值)。清除率的计算如式(1)所示。

式中：A0为空白组的吸光度；A1为加入0.03%双氧水的吸光度；A样品为加入样品和0.03%双氧水的吸光度。

1.3.1.2 五味子乙素提取液清除超氧阴离子自由基的测定

样品制备：稀释分离纯化后的五味子乙素提取液，使五味子乙素的质量浓度分别为：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，另配制相同质量浓度梯度的抗坏血酸溶液作比较。具体步骤参照邻苯三酚自氧化法[18-19]，在波长325nm处测定吸光度。

式中：A00为空白组吸光度；A01为加入邻苯三酚溶液的吸光度；A10为加入样品溶液的吸光度； A325为加入样品和邻苯三酚溶液的吸光度。

1.3.2 五味子乙素提取液抑菌作用测定

1.3.2.1 药液制备

将分离纯化后的五味子乙素冻干粉末，用乙醇配制成质量浓度为0.25、0.5、1、2、4、8mg/mL溶液，备用。

1.3.2.2 菌种活化

将融化的培养基装入试管，灭菌后摆斜面。在无菌条件下用划线法将供试菌种移接入相应的斜面培养基上，于37℃条件下培养18～24h，进行菌种斜面活化。

1.3.2.3 供试菌株悬浮液的制备

将活化好的菌种，在无菌条件下，每种分别挑取两环菌苔，各用无菌水稀释，配制成一定浓度的菌悬液。

1.3.2.4 含菌平板制作

将新鲜配制的培养基于121℃条件下灭菌，当培养基冷至50～60℃时，于超净工作台上将培养基倒入灭菌的90mm培养皿中，每皿15～20mL培养基，待平板冷却后，每皿中加入0.5mL菌悬液，用三角玻璃涂棒均匀涂成薄板备用。

1.3.2.5 抑菌作用测定

参照管碟法，在已放至室温的培养基上等距均匀放3个已灭菌的牛津杯，在其中两个牛津杯内用微量移液器加入等量不同质量浓度的五味子乙素提取液，另外一个作为对照，加入等量乙醇溶液，每个质量浓度重复3次，37℃培养24h，观察并测量抑菌环直径，比较抑菌效果(抑菌圈在15mm以上，抑菌能力强；抑菌圈在10～15mm，抑菌能力较强；抑菌圈在10mm以下，抑菌能力弱)。

2 结果与分析

2.1 五味子乙素提取液清除自由基

2.1.1 五味子乙素结构鉴定

图1为将HPLC纯化后五味子乙素提取液经冻干后的五味子乙素的红外光谱图，样品在2959cm-1处有吸收峰，为—CH2伸缩振动峰，说明乙素结构中有烷基的存在。样品在1619cm-1左右处有吸收峰，为芳环骨架振动引起的很强的吸收峰，说明了乙素结构中有苯环的存在。样品在1418cm-1左右处有吸收峰，为羧基的C＝O的伸缩振动峰，说明了乙素结构中有羧基的存在。样品在1329cm-1处有吸收峰，为羧基的C＝O的对称伸缩振动峰，说明了乙素有羧基的存在。样品在1046cm-1处有吸收峰，为—OH的变角振动峰，说明了乙素结构中有羟基的存在。鉴定后的基团与图2中五味子乙素结构符合，基本判定样品为五味子乙素。图4为五味子乙素提取液的HPLC图与图3五味子乙素标准品的HPLC对照，根据五味子乙素成分的峰面积的百分比得出其纯度(纯度≥98%)。

图1 五味子乙素的红外光谱图Fig.1 Infrared spectrum of schisandrin B from Schisandra chinensis

图2 五味子乙素化学结构Fig.2 Structure of schisandrin B

图3 五味子乙素标准品HPLC图Fig.3 HPLC profile of schizandrin B standard

图4 五味子乙素提取液HPLC图Fig.4 HPLC profile of schisandrin B from Schisandra chinensis

2.1.2 五味子乙素提取液清除羟自由基

图5 五味子乙素提取液清除羟自由基能力Fig.5 Comparison of hydroxyl radical scavenging effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B and vitamin C

由图5可知，在0.1～0.5mg/mL的质量浓度范围内，二者对羟自由基清除作用较好，并且其清除效果都与其质量浓度有一定的关系，随质量浓度的增加，对自由基的清除效果增强。另外，总体上五味子乙素提取液对羟自由基清除作用大于VC，其半数清除质量浓度为0.2mg/mL，当质量浓度为0.5mg/mL，其清除率接近100%，而抗坏血酸的半数清除质量浓度为0.26mg/mL。

2.1.3 五味子乙素提取液清除超氧阴离子自由基

图6 五味子乙素提取液清除超氧阴离子自由基能力Fig.6 Comparison of superoxide anion radical scavenging effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B and vitamin C

由图6可知，在0.1～0.5mg/mL的质量浓度范围内，五味子乙素和VC二者对超氧阴离子自由基清除作用都较好，清除效果也都与其质量浓度有一定的关系，随质量浓度的增加，对自由基的清除效果增强。抗坏血酸对超氧阴离子自由基清除作用总体上大于五味子乙素提取液，其半数清除质量浓度为0.16mg/mL，而五味子乙素提取液的半数清除质量浓度为0.24mg/mL。

2.2 五味子乙素提取液的抑菌作用

表1 不同质量浓度的五味子乙素提取液对细菌生长的抑制作用Table1 Antibacterial effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B at different concentrations

表2 五味子乙素提取液对供试菌的最低抑菌浓度Table 2 MIC of Schisandra chinensis-derived schisandrin B against tested bacteria

由表1、2可知，五味子乙素提取液在一定的质量浓度范围内对供试的几种细菌都有抑菌活性，其中对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最强(图7)，最低抑菌浓度为0.25mg/mL，对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制作用最弱，最低抑菌浓度为1mg/mL。同时根据抑菌圈的变化，五味子乙素提取液对供试菌的抑制作用与其质量浓度也有一定的关系，总体上随着其质量浓度的提高，抑菌作用增强。

图7 五味子乙素提取液对金黄色葡萄球菌(a)和白色念珠菌(b)抑制作用Fig.7 Bacteriostasis of Schisandra chinensis-derived schisandrin B against Staphylococcus aureus and Candida albicans

表3 不同质量浓度的五味子乙素提取液对真菌生长的抑制作用Table 3 Anti-fungal effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B at different concentrations

由表3可知，在0.25～8mg/mL质量浓度范围内，对供试的3种真菌抑菌活性较弱，特别是两种霉菌，基本没有抑菌圈的出现，虽然南阳酵母在五味子乙素质量浓度为4mg/mL时产生抑菌圈，但抑菌圈较小，抑制能力较弱。

3 结 论

3.1 五味子乙素提取液对自由基清除效果明显，其中对羟自由基清除作用大于相同质量浓度的VC，其半数清除质量浓度0.2mg/mL；对超氧阴离子自由基清除作用小于VC，其半数清除质量浓度为0.24mg/mL。

3.2 五味子乙素提取液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用，其中对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度为0.25mg/mL，对根霉、黑曲霉、南阳酵母无明显抑菌活性。

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Free Radical-scavenging and Antimicrobial Activities of Schisandrin B from Schisandra chinensis

LI Bin，MENG Xian-jun*，XUE Xue，WU Qian，LI Yuan-su，WANG Yan-qun(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Schisandrin B obtained from the fruits of Schisandra chinensis by supercritical carbon dioxide extraction and subsequent preparative HPLC separation was tested for its free radical-scavenging and antimicrobial activities in vitro. The results showed that Schisandra chinensis-derived schisandrin B had higher hydroxyl radical scavenging effect (IC50 = 0.2 mg/mL)but lower superoxide anion radical scavenging effect (IC50 = 0.24 mg/mL) when compared with vitamin C at the same concentrations. The compound could inhibit Staphylococcus aureus, Candida albicans, Salmonella, E.coli and Bacillus subtilis,especially against Candida albicans and Staphylococcus aureus with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.25 mg/mL.However, no obvious inhibitory effect on Rhizopus, Aspergillus niger or Nanyang yeast was observed.

Schisandra chinensis (Turcz.) Baill；schisandrin B； free radical-scavenging activity；antimicrobial activity

TS201.2

A

1002-6630(2011)05-0079-04

2010-05-23

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAI09B04)；沈阳农业大学青年教师基金项目(2010)

李斌(1979—)，男，讲师，博士，研究方向为天然产物提取及功能性食品开发。E-mail：libinsyau@163.com

*通信作者：孟宪军(1960—)，男，教授，博士，研究方向为食品深加工及综合利用。E-mail：mengxjsy@126.com