韩 飞，周孟良

(国家粮食局科学研究院，北京 100037)

过氧化氢诱导HepG2细胞产生氧化应激细胞模型的建立

韩 飞，周孟良

(国家粮食局科学研究院，北京 100037)

不同浓度过氧化氢作用人肝癌细胞(HepG2)4h后，用单细胞凝胶电泳技术测定DNA损伤状况，分光光度法测定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，研究过氧化氢的最佳作用浓度，构建体外氧化应激细胞模型。结果表明，过氧化氢的最佳作用浓度为100μmol/L，作用细胞的时间选择4h，可以成功构建以过氧化氢为氧化应激诱导剂的HepG2细胞体外氧化应激模型。

过氧化氢；HepG2细胞；氧化应激模型

氧化应激是指细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物而引起的细胞损伤。自由基作用于生物大分子，破坏细胞结构，最终导致诸如动脉粥样硬化、糖尿病、炎症、衰老、癌症等的发生发展[1]。建立成功可靠的氧化应激模型，对于揭示氧化应激机制以及研究和筛选抗氧化药物和功能食品都有重要意义[2]。过氧化氢是一种重要的活性氧，极易透过细胞膜，与细胞内铁离子通过Fenton反应形成高活性的自由基，导致一系列反应，其易于获得，性质相对稳定，所以它已成为研究细胞氧化损伤的重要工具[3-4]。本研究以人肝癌细胞(HepG2)为基础，以过氧化氢为氧化应激诱导剂构建体外氧化应激细胞模型。以单细胞凝胶电泳技术测定DNA损伤状况以及分光光度法测定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以摸索过氧化氢的最佳作用浓度，构建体外氧化应激细胞模型，为后续研究筛选抗氧化剂的生物芯片实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

HepG2(人肝癌细胞) 协和医科大学。

青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胰蛋白酶 美国Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；H2O2、二甲基亚砜、EDTA、正常熔点琼脂糖 北京化学试剂公司；MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、GSH-Px活力测试盒 南京建成生物工程研究所；测定与分析用水均为超纯水。

HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；101A-3B电热鼓风干燥箱 上海安亭科学仪器有限公司；MCO-18AIC CO2培养箱 日本三洋公司；SW-GJ-2FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；液氮罐 美国Thermo公司；3K15冷冻离心机 美国Sigma公司；37XB倒置显微镜 上海光学仪器五厂；奥林巴斯IX71荧光显微镜 日本奥林巴斯株氏会社；PE Lambda35紫外-可见分光光度计 美国Perkin Elmer仪器公司；BIORAD电泳仪、BIO-RAD 680酶标仪 美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌细胞(HepG2)培养[5-7]

将HepG2细胞按5×105个/mL接种在含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mmol/L Hepes缓冲液、2mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的DMEM培养基中(pH 7.2)，37℃、5% CO2温育。细胞为多角形贴壁生长，每2～3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 实验分组及药物处理

实验分为4组，分别为正常对照组，加入常规培养液；H2O2处理组，加入培养液和H2O2，H2O2终浓度分别为10、100、1000μmol/L。

1.2.3 噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率[8]

取对数生长期HepG2细胞以105个/mL密度接种于96孔板上，共设4组，每组5孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，去除培养液，同上加药物处理，每孔100μL作用4h，然后每孔加入10μL 5g/L的MTT，温育4h，去除培养液及MTT，每孔加入200μL二甲基亚砜，用酶标仪测定各孔在波长570nm处的吸光度。

1.2.4 单细胞凝胶电泳法检测细胞DNA损伤[9]

取对数生长期的HepG2细胞以105个/mL密度接种于12孔板上，共设4组，于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，去除培养液，同上加药物处理，每孔700μL作用4h，然后去除培养液，4℃ PBS洗一次，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，1000r/min离心5min后收集细胞，用磷酸缓冲液(PBS)重悬，密度为1×105个/mL。将加热溶解的0.8%正常熔点琼脂糖(NMA)冷却至45～60℃时，取120μL铺于磨砂载玻片上，盖上盖玻片，4℃凝固10min。取100μL单细胞悬液与37℃等体积1%的低熔点琼脂糖(LMA)混匀液，铺于第二层胶上，盖上盖玻片，4℃固定15min后揭去盖玻片，将胶板浸于4℃裂解液(含2.5mol/L NaCl、100mmol/L Na2EDTA、10mmol/L Tris，pH10.0，临用前加10%的DMSO，1%的TritonX-100)中裂解1.5h。取出载玻片用蒸馏水轻柔漂洗2次，以免琼脂糖脱落，然后将胶板浸于4℃电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA、300mmol/L NaOH，pH13.0)解螺旋20min，电泳(17V，200mA)20min。电泳结束后，胶板用中和缓冲液(0.4mol/L Tris，pH7.5)中和两次，每次10min，中和完全后用2μg/mL的EB 50μL染色5min，蒸馏水脱色10min。以上操作均在4℃暗处进行[10-11]。

荧光显微镜10×目镜、20×物镜下观察结果(激发光波长510～560nm)及拍照。每组随机选择20个细胞计数，使用CASP软件测量照片中尾矩(从彗星头的右边界到彗星尾部末端的距离与尾部DNA含量的乘积)和Olive尾矩(从头光密度重心到尾光密度重心的距离与尾部DNA含量的乘积)这两个指标，以反映细胞DNA的损伤程度。

1.2.5 MDA、SOD、GSH-Px的测定

取药物作用的细胞，用PBS洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，制成细胞悬液，4000r/min离心5min收集细胞，用PBS洗一遍，加入细胞裂解液(150mmol/L NaCl、150mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1% Triton X-100，pH8.0)使细胞裂解[12-13]，于4℃离心1h，以上清液作为样本，参照南京建成生物工程研究所提供的相应试剂盒说明书测定细胞内MDA含量和SOD、GSH-Px活性。SOD活力单位定义为每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD酶活力为一个酶活力单位(U) ；GSH-Px活力单位定义为每毫克蛋白质每分钟扣除非酶反应，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个活力单位(U)。蛋白质定量采用考马斯亮蓝比色法测定。

1.2.6 统计分析

采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析，两组间的数据比较采用t检验。实验数据用±s的形式表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 过氧化氢对HepG2细胞存活率的影响

不同浓度的H2O2作用于HepG2细胞4h后，低浓度10、100μmol/L H2O2作用细胞存活率与正常对照组相比没有显著变化，500、1000μmol/L H2O2作用细胞存活率与正常对照组相比显著降低，且随着H2O2浓度的升高，细胞存活率逐渐降低(图1)。

图1 H2O2对HepG2细胞存活率的影响(±s，n=5)Fig.1 Effect of H2O2 on HepG2 cell survival (±s, n = 5)

2.2 过氧化氢对肝癌细胞DNA损伤的影响

不同浓度的H2O2作用于HepG2细胞4h后，与正常对照组比较，10μmol/L H2O2作用细胞，尾矩和Olive尾矩虽有增加，但无显著差异，从图中也未见其尾巴有显著增长，100、1000μmol/L H2O2作用细胞，尾矩和Olive尾矩显著增加，尾巴也出现显著性增长，并随着H2O2浓度的升高，尾矩和Olive尾矩也同时增长(图2，表1)。Scolastici等[14]报道100μmol/L H2O2作用HepG2细胞DNA也出现显著性损伤，然而细胞存活率没有产生变化。

表1 H2O2对HepG2细胞DNA损伤的影响(±s，n=20)Table 1 Effect of H2O2 on DNA damage in HepG2 cell (±s, n = 20)

表1 H2O2对HepG2细胞DNA损伤的影响(±s，n=20)Table 1 Effect of H2O2 on DNA damage in HepG2 cell (±s, n = 20)

注：*.与正常对照组相比，差异显著(P＜0.05)。

组别 尾矩 Olive尾矩正常对照组 1.60±2.20 2.31±2.27 10μmol/L H2O2组 3.03±2.45 3.74±2.52 100μmol/L H2O2组 27.08±8.90* 17.50±5.37*1000μmol/L H2O2组 35.40±7.35* 31.12±6.45*

图2 荧光显微镜下DNA形态(×200)Fig.2 DNA observed under fluorescence microscope (×200)

2.3 过氧化氢对肝癌细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影响

表2 H2O2对HepG2细胞MDA含量、SOD及GSH-Px活性的影响(x± s，n=3)Table 2 Effect of H2O2 on MDA content, SOD and GSH-Px activities in HepG2 cell (x± s，n=3)

不同浓度的H2O2作用于HepG2细胞4h后，与正常对照组比较，10μmol/L H2O2作用细胞，MDA含量和SOD、GSH-Px活性都未发生显著变化，100、1000μmol/L H2O2作用细胞，其值都发生了显著变化。随着H2O2浓度的升高，MDA含量也同时升高，而SOD和GSH-Px活性却在同时降低(表2)。

3 讨 论

一个好的模型必须具备特异性、模拟性和可控性。本实验的目的是构建氧化应激的细胞模型，该模型在适宜浓度的H2O2诱导下，细胞的DNA被外泄、损伤，相关的基因表达发生变化，细胞内的脂质、蛋白质被损伤，但是这种损伤不会造成细胞死亡，而且在适宜的抗氧化剂的作用下，这些损伤还有可能被修复。由于4h是测量相关基因产生表达变化的最小共有间隔[15]，同时考虑到长时间的氧化作用会对细胞造成不可逆损伤甚至死亡[9]，因此过氧化氢作用细胞的时间选择为4h。从实验结果可见，当H2O2作用HepG2细胞浓度为100 μmol/L，作用时间为4h时，细胞存活率没有显著降低，而细胞DNA出现了显著性损伤，尾矩和Olive尾矩显著增加，尾巴也出现显著性增长，且MDA含量、SOD、GSH-Px活性都发生了显著变化，说明在此浓度下，HepG2细胞的细胞核内DAN已外泄，且细胞内的脂质和酶系都发生了显著变化，但是这种损伤不会造成细胞死亡，因此过氧化氢的最佳作用浓度选为100 μmol/L。Farombi等[9]用同样浓度的过氧化氢(100 μmol/L)处理肝细胞，利用单细胞凝胶电泳试验观察到DNA断裂水平的增多，从DNA水平证明了过氧化氢氧化损伤模型可以提供一个较理想的抗氧化实验平台。郑延松等[3]用低浓度过氧化氢(100 μmol/L)成功建立了心肌细胞氧化损伤模型，且实验中发现，低浓度的过氧化氢随着时间的延长可以表现出明显的细胞损伤效应，先是细胞功能的改变，损伤积累到一定程度就触发了细胞的器质性损害和不可逆损伤。

本实验结果表明，过氧化氢作用浓度为100 μmol/L，作用时间4h，可以成功构建以过氧化氢为氧化应激诱导剂的HepG2细胞体外氧化应激模型。该模型的建立为揭示氧化应激机制以及研究和筛选抗氧化药物和功能食品奠定了实验基础。

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An Experimental HepG2 Cell Model of Hydrogen Peroxide Induced DNA Oxidative Injury

HAN Fei，ZHOU Meng-liang
(Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

The oxidative effect of 4 h exposure to H2O2 at different concentrations on HepG2 cells was measured by determining DNA damage by single cell gel electrophoresis technique and assaying MDA content and the activities of SOD and GSH-Px in HepG2 cells. An experimental model of oxidative stress was established based on the optimal concentration of H2O2. The results showed that the optimal H2O2 concentration determined was 100μmol/L and construction of the HepG2 cell model of oxidative injury came to success after 4 h treatment with H2O2 at this concentration.

H2O2；HepG2 cell；oxidative stress model

Q505

A

1002-6630(2011)05-0055-03

2010-07-12

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金项目(ZX0706)

韩飞(1973—)，女，副研究员，博士，主要从事粮油(食品)营养与功能研究。E-mail：hf@chinagrain.org