贾贵东，杨建雄*，王 芳，徐 乐，包 闽

(陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062)

柿子皮提取物的抗氧化活性

贾贵东，杨建雄*，王 芳，徐 乐，包 闽

(陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062)

为评价柿子皮提取物(persimmon peel extracts，PPE)的抗氧化活性，采用不同的抗氧化评价方法以及Fe2+-H2O2或Fe2+-VC诱导的离体鼠肝线粒体损伤模型。结果显示：PPE具有良好的总抗氧化活性、还原力、脂质过氧化抑制力以及自由基清除能力；清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基(O2·)、羟自由基(·OH)的IC50值分别为57、137、425μg/mL；另外，PPE能显著地抑制线粒体脂质过氧化、肿胀、蛋白氧化和ATPase活性降低。说明PPE有明显的体外抗氧化活性，有可能作为一种天然抗氧化剂的新原料。

柿子皮；抗氧化；自由基；线粒体

柿为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros kaki)植物，生长于热带、亚热带及暖温带地区，在日本、韩国、中国、巴西、意大利等国广泛栽培[1]。柿含有很多生物活性成分，如多酚、黄酮、萜类化合物、类固醇、饮食纤维、类胡萝卜素和矿物质[2]。在中国，柿果和柿叶被用于治疗咳嗽、过度紧张、呼吸困难、麻痹、冻疮、烧伤及出血，也有抗氧化和清除自由基效应的报道[3]。

柿子皮是加工柿子饼的下脚料，不但含有大量的维生素和胡萝卜素，还富含粗蛋白质和膳食纤维、果胶。柿子皮只是部分作为食品填料，大部分白白浪费，近年来已有柿子皮多酚的除臭效果[4]及其对细胞的保护作用[5]、柿子皮果胶对金的选择吸附[6]、柿子皮提取物的药理活性[7]、以及柿子皮综合利用和深加工[8]的相关报道。但是，关于柿子皮活性成分的抗氧化活性还没有系统的研究。因此，本实验用70%乙醇提取，经DA-201型大孔吸附树脂初步纯化，制备了柿子皮提取物(persimmon peel extracts，PPE)，测定PPE主要活性成分含量，采用体外化学模拟体系测定PPE的抗氧化活性和对鼠肝线粒体的保护作用，以期进一步揭示柿子皮的药理作用机制，促进柿子皮作为天然抗氧化剂原料的开发和利用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

柿子(Diospyros kaki)采集于陕西师范大学校园，柿子皮低温干燥后粉碎，过筛备用。

1,1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)、2,6二叔丁基对甲酚(BHT)、抗坏血酸(VC)、焦性没食子酸(PA)、芦丁(rutin)、葡萄糖、β-胡萝卜素、亚油酸 美国Sigma公司；NBT、PMS、NADH、脱氧核糖 德国Applichem公司；DA-201型大孔吸附树脂、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、甲醇、Tween-20、铁氰化钾(K3Fe(CN)6)、三氯化铁(FeCl3)、双氧水、硫酸亚铁、无水乙醇均为国产分析纯。

TU-1810型可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SIGMAD-37520型高速冷冻离心机 美国Sigma公司。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠(约200g)由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 PPE的制备

取柿皮粉末200g，用70%乙醇溶液作为提取试剂，料液比1:10(m/V)，分装在5个圆底烧瓶中，混匀，装上回流冷凝管，水浴加热保持溶液近沸状态，80℃回流提取2h后，将滤液转入烧杯，残渣用以上方法重复提取1次，合并两次滤液，并于50℃减压浓缩后，得粗提物36.2g，取7.2g粗提物制成40mL水溶液，上载于含DA-201型大孔吸附树脂的玻璃色谱柱(5cm×80cm)上，以2.5mL/min的流速用3倍床体积的水洗脱除杂后，用3倍床体积的50%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液并于50℃减压浓缩，浓缩液置培养皿中，在鼓风干燥箱中50℃烘干即为所得提取物PPE，并计算得率(以每100g柿子皮粉末中含PPE的克数表示)。

1.3.2 PPE中活性成分含量测定

以葡萄糖、芦丁、焦性没食子酸为标准品分别测定PPE中总糖、总黄酮及多酚含量，方法分别采用苯酚硫酸法[9]、亚硝酸钠-硝酸铝法[10]、Folin-酚法[11]。结果分别根据相应标准曲线的线性回归方程计算出所测PPE中总糖、总黄酮及多酚的相应质量浓度(mg/mL)，进一步可以换算出PPE中总糖、总黄酮及多酚的含量。

式中：ω为总糖、总黄酮及多酚的相应含量；ρ1表示所加样品中PPE的质量浓度；ρ2表示根据线性回归方程计算出的PPE中总糖、总黄酮及多酚的相应质量浓度。

1.3.3 PPE抗氧化活性测定

对DPPH自由基、O2·清除能力、总抗氧化能力、还原力测定参照张改平等[12]方法；对·OH的清除能力测定参照Sakanaka等[13]的方法；抗脂质过氧化能力测定参照张尔先等[14]方法。以BHT、VC、芦丁、PA为阳性对照。

式中：A样为加入BHT、VC、芦丁、PA、PPE的样品溶液的吸光度；A阴性对照为未加入BHT、VC、芦丁、PA、PPE的样品溶液的吸光度。

1.3.4 PPE对鼠肝线粒体的保护作用

1.3.4.1 鼠肝线粒体制备及蛋白含量测定

鼠肝线粒体制备参照Kamat等[15]的方法，以牛血清白蛋白为标准品，通过Lowry法测定线粒体悬浮液中蛋白质的含量。

1.3.4.2 线粒体损伤模型的建立

采取Fe2+-H2O2体系和Fe2+-VC体系产生·OH诱导离体鼠肝线粒体损伤。

1.3.4.3 对Fe2+-H2O2诱导鼠肝线粒体脂质过氧化的测定

参照TBA法间接测定脂质过氧化产生的丙二醛(MDA)量以反映过氧化程度，参照杨建雄等[16]的方法测定。

式中：A样为加入PPE的样品溶液的吸光度；A阴性对照为未加入PPE的样品溶液的吸光度。

1.3.4.4 对Fe2+-VC诱导鼠肝线粒体肿胀度的测定

根据线粒体肿胀导致其浑浊度降低，参照盛伟等[17]的方法，测定A520nm评价线粒体的肿胀程度。

1.3.4.5 对Fe2+-VC诱导鼠肝线粒体中蛋白质羰基含量的测定

采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法，具体操作步骤参照Aakatay等[18]的方法。羰基浓度用摩尔消光系数ε = 22000L/(mol·cm)来计算，羰基含量用每mg蛋白中所含羰基的nmol表示。

1.3.4.6 对Fe2+-VC诱导鼠肝线粒体中ATP酶活性的测定

按Okatani等[19]的方法，以KH2PO4为标准品制作标准曲线(钼蓝法测定磷含量)。ATP酶的活性可以用每毫克蛋白质每小时新生成的无机磷的量(μmol/(mg·h))表示。

1.3.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 PPE得率及活性成分含量

结果分析，PPE得率为2.17%，总糖、总黄酮及多酚含量分别根据线性回归方程：y=7.3293x+0.0106(R2=0.9944，y为吸光度，x为质量浓度)、y=0.9779x+0.0305(R2=0.9942)、y=32.423x + 0.002(R2=0.9996)计算，其含量分别为15.63%、25.85%、47.05%。

2.2 PPE对DPPH自由基的清除率

图1 PPE、BHT和VC对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging activity of PPE , BHT and VC on DPPH free radicals

抗氧化剂能够清除DPPH自由基归因于其提供质子的能力。图1表明，PPE能很好的清除DPPH自由基，且清除率随着质量浓度的升高而增大，虽然在相同质量浓度时对DPPH自由基的清除率PPE＜BHT＜VC，但在150μg/mL时三者对DPPH自由基清除率接近，达到93%左右。PPE的IC50(57μg/mL)虽高于VC(15μg/mL)和BHT(20μg/mL)，但其来自天然材料，安全性比人工合成的BHT好，稳定性比VC高。说明PPE是良好的质子供体，对DPPH自由基的清除能力可能与其所含的黄酮和其他多酚有关。

2.3 PPE对O2·的清除率

图2 PPE、PA和芦丁对O2·的清除率Fig.2 Scavenging activity of PPE, PA and rutin on superoxide anion free radicals

如图2所示，在所测剂量范围内，PPE、PA和芦丁对O2·具有较强的清除率，且呈较好的量效关系，其IC50分别为137、139、88μg/mL。PPE对O2·的清除率低于芦丁，但高于PA，在400μg/mL时最高达(88.05±4.79)%，说明PPE是一种很好的O2·清除剂，其较高的清除能力可能是由于PPE中混合成分在清除O2·时存在协同作用。

2.4 PPE对·OH的清除率

图3 PPE和VC对·OH的清除率Fig.3 Scavenging activity of PPE and VC on hydroxyl radicals

如图3所示，在所测质量浓度范围内，PPE具有较好的·OH清除率，且表现出剂量依赖性，IC50为425μg/mL(VC为62μg/mL)。PEE能够清除化学性质最活泼，反应性极强的羟自由基，说明PPE具有良好的抗氧化作用，PPE中的多酚可能是清除·OH的主要成分。

2.5 PPE对脂质过氧化的抑制作用

图4 PPE、VC和芦丁对脂质过氧化的抑制率Fig.4 Inhibition activity of PPE, VC and rutin on lipid peroxidation

脂质过氧化产物是造成细胞膜结构和细胞损伤的重要原因之一。由图4可看出，PPE、VC和芦丁对脂质过氧化有明显的抑制作用，且在测试质量浓度范围内呈良好的量效关系，IC50分别为46、155μg/mL和37μg/mL。PPE良好的抑制脂质过氧化作用可能是由于其中含有的酚羟基具有提供电子的能力，使脂质氧化过程中产生的脂质自由基失活，从而中断其引起进一步氧化的链式反应。

2.6 PPE的总抗氧化活性

β-胡萝卜素是一种多烯色素，易被反应体系中的亚油酸自氧化产生的过氧化物氧化而褪色，当反应体系中有抗氧化剂时，褪色速度减缓。由图5可见，当体系中加入不同质量浓度的VC、PPE和BHT后，β-胡萝卜素的褪色程度较阴性对照大大减缓，样品质量浓度越大褪色速度越慢。可以看出，PPE有较强的总抗氧化活性。

图5 PPE、VC和BHT的总抗氧化活性Fig.5 Total antioxidant activity of PPE, VC and BHT

2.7 PPE的还原力

图6 PPE、VC和BHT的还原力Fig.6 Reducing power of PPE, VC and BHT

一种物质的还原力大小可以反映其潜在抗氧化性能。如图6所示，随着质量浓度的增大，其还原力逐渐增强，在同质量浓度时PPE、VC和BHT的还原力大小顺序为：VC＞BHT＞PPE，PPE在500μg/mL时，吸光度为0.703±0.049，与VC在100μg/mL时的吸光度相当。PPE良好的还原能力说明其含有的多酚和黄酮类物质可以作为良好的电子供体，具有潜在的抗氧化能力。

2.8 PPE对鼠肝线粒体脂质过氧化的影响

图7 PPE对线粒体脂质过氧化的影响Fig.7 Effect of PPE on lipid peroxidation in mouse liver mitochondria

通过间接测定MDA的生成量来反映受试物抑制线粒体脂质过氧化能力。如图7所示，当反应体系中有PPE时，明显抑制脂质过氧化，且随着质量浓度的增加而增强，在剂量范围内可高达(92.02±3.94)%。提示PPE对鼠肝线粒体脂质氧化有明显的抑制作用，这可能是由于PPE能清除脂质氧化诱导产生的·OH及由·OH诱导产生的脂质自由基或阻断脂质自由基链式反应。

2.9 PPE对鼠肝线粒体肿胀度的影响

图8 PPE对线粒体肿胀度的影响Fig.8 Effect of PPE on mouse liver mitochondrial swelling

线粒体肿胀是由于线粒体受损，膜结构发生改变所致。由图8可见，随着测试时间的延长，各组A520nm值下降，其中正常组变化不大(100min后吸光度仅降低了0.037)，损伤组下降幅度最大(20min时已经降低了0.147)，样品组下降趋势减缓，且随着样品质量浓度的增大减缓趋势更为明显，说明PPE可以抑制·OH所导致的氧化损伤，使线粒体肿胀减轻。

2.10 PPE对鼠肝线粒体蛋白羰基含量的影响

图9 PPE对线粒体蛋白羰基含量的影响Fig.9 Effect of PPE on protein carbonyl content of mouse liver mitochondria

蛋白质中的氨基酸容易受到自由基的攻击，导致蛋白羰基的积累。从图9可知，与正常组相比，损伤组蛋白羰基水平显著升高(P＜0.001)，高达(37.63±1.16)nmol/mg，而正常组的羰基含量仅为(4.73±1.67)nmol/mg；样品组蛋白羰基含量虽高于正常组，但随着PPE质量浓度的增加羰基含量较损伤组逐渐减小，且差异显著(P＜0.01，P＜0.001)，表明PPE可以有效地抑制蛋白质氧化损伤，在400μg/mL时，羰基含量为(9.45±2.96)nmol/mg，抑制率高达86.64%，说明PPE具有较强的抗氧化作用。

2.11 PPE对鼠肝线粒体ATP酶活性的影响

图10 PPE对线粒体ATP酶活性的影响Fig.10 Effect of PPE on ATPase activity of mouse liver mitochondria

ATP酶能够水解ATP生成ADP和无机磷，通过测定无机磷的释放量即可反映线粒体ATP酶的活性。图10表明，损伤组线粒体ATP酶活性较正常组显著下降(P＜0.001)，当反应体系存在PPE时，ATP酶得到保护，且差异显著(P＜0.01，P＜0.001)，当PPE质量浓度为600μg/mL时，ATP酶的活性接近正常水平，这充分说明PPE在线粒体受损时对ATP酶活性影响较大，能够抑制ATP酶氧化损伤。

3 结 论

PPE具有很强的清除DPPH自由基、O2·能力和抑制脂质过氧化能力，有较强的清除·OH能力和总抗氧化活性，具有一定的还原力。另外，PPE能显著地抑制鼠肝线粒体蛋白质和脂质的氧化损伤、保护ATP酶的活性和抑制线粒体发生肿胀，所有测定指标都有较好的剂量依赖性，表明PPE具有较好的抗氧化活性，说明柿子皮有可能作为新型天然抗氧剂的原料。

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Antioxidant Activity of Persimmon Peel Extracts

JIA Gui-dong，YANG Jian-xiong*，WANG Fang，XU Le，BAO Min
(College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

In order to evaluate the antioxidant activity of persimmon peel extracts (PPE) in vitro, different antioxidant evaluation assays and a mouse model of liver mitochondrial damage induced by Fe2+-H2O2 or Fe2+-VC in vitro were used. The results showed that PPE possessed excellent total antioxidant activity, reducing power, inhibitory activity against lipid peroxidation and radical scavenging activity. The IC50 values against DPPH, superoxide anion and hydroxyl radicals were 57, 137μg/mL and 425 μg/mL,respectively. In addition, PPE could significantly protect mitochondria from lipid peroxidation, swelling, protein oxidation and the reduction of ATPase activity in rats. In conclusion, the current study showed that PPE can resist oxidation obviously in vitro and be utilized as a new natural source of antioxidant.

persimmon peel；antioxidant；free radical；mitochondria

R151.2

A

1002-6630(2011)05-0045-05

2010-06-19

国家自然科学基金项目(20175012)；陕西师范大学大学生开放性实验基金项目

贾贵东(1982—)，男，硕士，主要从事天然产物的分离及功能评价研究。E-mail：jgdong1012@qq.com

*通信作者：杨建雄(1954—)，男，教授，硕士，主要从事天然产物的分离及功能评价研究。

E-mail：jxyang@snnu.edu.cn