刘文颖，林 峰，金振涛，陈 亮，易维学，蔡木易,*

(1.中国食品发酵工业研究院，北京 100027；2.北京大学公共卫生学院，北京 100083)

玉米低聚肽的体外抗氧化作用

刘文颖1，林 峰2，金振涛1，陈 亮1，易维学1，蔡木易1,*

(1.中国食品发酵工业研究院，北京 100027；2.北京大学公共卫生学院，北京 100083)

在对玉米低聚肽的蛋白质含量、氨基酸组成和分子质量分布进行分析的基础上，从DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力以及还原能力4个方面对玉米低聚肽的体外抗氧化活性进行考察。组成分析显示：总蛋白质含量为89.28%，酸溶蛋白质占总蛋白质含量的94.31%；氨基酸组成独特，富含抗氧化性氨基酸，其中亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量较高；相对分子质量小于1000的组分高达93.05%，主要分布在132～576范围内。体外抗氧化实验结果显示：玉米低聚肽对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的半抑制浓度(IC50值)分别为：1.9、5.4mg/mL和14.9mg/mL，质量浓度为5.0mg/mL时的还原能力与0.02mg/mL的抗坏血酸相当，并且抗氧化能力与其质量浓度呈现剂量关系。

玉米；低聚肽；氨基酸组成；分子质量分布；抗氧化活性

玉米低聚肽是从天然食品玉米中提取的玉米蛋白经过酶解技术而获得的小分子肽物质。较玉米蛋白而言，不仅易被人体吸收，具有特殊的生理功能[1]，而且大大改善了玉米蛋白水难溶性、利用率低的缺陷。

玉米低聚肽含有高比例的亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸以及支链氨基酸和中性氨基酸，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸。这种特殊氨基酸组成[2]，使得玉米低聚肽具有多种功能，如降血压、解酒、降低血清胆固醇等，而这些功能都与其抗氧化性有直接关系[3]。但是目前研究重点主要是降血压等活性，而对于玉米低聚肽的抗氧化活性缺乏全面和系统的研究。因此，本实验在对玉米低聚肽的蛋白质含量、氨基酸组成和分子质量分布进行分析的基础上，对玉米低聚肽的体外抗氧化活性进行研究，为其开发和利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米低聚肽：以玉米为原料，利用双酶解方法制得的粉状产品，由北京中食海氏生物技术有限公司提供。

抗坏血酸、三氯化铁、铁氰化钾、硫酸亚铁、水杨酸钠(均为分析纯) 广东汕头市西陇化工有限公司；2,2-二苯基-1-苦味肼基自由基(DPPH)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)(均为色谱纯) 美国Sigma公司；邻苯三酚、三氯乙酸(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司；835-50型氨基酸分析仪 日本日立公司；UV22100紫外-可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；QSY-Ⅱ型凯式定氮仪 北京强盛分析仪器制造中心；LG10-2.4A型高速离心机 北京医用离心机厂；GSY-Ⅱ电热恒温水浴锅 北京市医疗设备厂；PH211 pH计 Hanna仪器公司；AB104-N电子天平 Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米低聚肽酶解工艺流程

玉米→淀粉酶、糖化酶除淀粉→玉米黄粉→碱性蛋白酶→灭酶→中性蛋白酶→灭酶→离心分离→脱苦脱色→脱盐→喷雾干燥→玉米低聚肽粉

1.3.2 蛋白质含量测定

总蛋白质含量测定：采用凯氏定氮法[4]；酸溶蛋白质含量测定：采用三氯乙酸法[5]。

1.3.3 氨基酸组成

参照GB/T14965—1994《食物中氨基酸的测定方法》，采用氨基酸自动分析仪进行分析[6]。对色氨酸的检测采用碱水解法，用5mol/L NaOH溶液水解，其余氨基酸以6mol/L HCl溶液水解测定。

1.3.4 相对分子质量分布

采用高效液相凝胶色谱法[7]。用流动相配制样品溶液1mg/mL，经孔径0.2μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后，用高效液相色谱仪进行凝胶过滤，紫外检测器进行检测，使用GPC软件处理色谱数据。同时配制1mg/mL肽标准品溶液，过膜后进样，制作相对分子质量校正曲线。4种肽标准品为：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(相对分子质量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(相对分子质量451)、杆菌酶(相对分子质量1450)、细胞色素C(相对分子质量12500)。色谱条件为：色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm；流动相：乙腈-水-三氟乙酸，体积比为45:55:0.1；流速：0.5mL/min；进样体积：10μL；检测波长：220nm；柱温：30℃。

1.3.5 DPPH自由基清除能力测定

[8]并有所改动。在具塞试管中加入样品溶液1.5mL和0.1mmol/L DPPH溶液1.5mL，摇匀后避光反应30min，于517nm波长处测定吸光度(AS)，同时测定1.5mL 0.1mmol/L DPPH溶液与1.5mL乙醇混合液的吸光度(AC)，以及1.5mL样品溶液与1.5mL乙醇混合液的吸光度(AB)。以抗坏血酸为对照。按式(1)计算DPPH自由基的清除率。

1.3.6 羟自由基清除能力测定

采用Smirnoff等[9]的水杨酸钠方法，并略有改动。反应体系为2.3mmmol/L FeSO4溶液1mL，2.3mmmol/L水杨酸钠-乙醇溶液1mL，样品溶液0.5mL，最后加入1mL 2.2mmmol/L H2O2溶液启动反应，37℃水浴锅中反应1h后，于510nm波长处测定吸光度。以抗坏血酸为对照。按式(2)计算羟自由基的清除率。

式中：A0为不加样品的吸光度；Ai为加入样品的吸光度；Aj为无显色剂时样品的本底值。

1.3.7 超氧阴离子自由基清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法[10]。在具塞试管中加入50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5mL，蒸馏水4.1mL，25℃水浴中保温20min后，立即加入样品溶液0.1mL，以及在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.3mL，迅速摇匀后于325nm波长处每隔30s测定吸光度。以抗坏血酸为对照。按式(3)计算超氧阴离子自由基的清除率。

式中：ΔA1/Δt为邻苯三酚自氧化时的反应速率；ΔA2/Δt为加入样品溶液后邻苯三酚自氧化时的反应速率。

1.3.8 还原能力测定

采用Oyaizu法[11]，并略有改动。反应体系为2mL样品溶液，2mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)和2mL 1g/100mL铁氰化钾，50℃水浴中保温20min后，加入2mL 10g/100mL三氯乙酸。取2mL反应液，加入2mL蒸馏水和0.4mL 0.1g/100mL FeCl3溶液，放置10min后，于700nm波长处测定吸光度。以抗坏血酸为对照。

2 结果与分析

2.1 玉米低聚肽的蛋白质含量

分析表明，玉米低聚肽中总蛋白质含量为89.28%，酸溶蛋白质含量为84.20%，占总蛋白质94.31%。表明玉米低聚肽中小分子蛋白质含量较高。

2.2 玉米低聚肽的氨基酸组成

表1 玉米低聚肽的氨基酸含量Table 1 Amino acid contents in COP

氨基酸是肽的基本组成成分，其种类和含量对肽的抗氧化活性有很大的影响[12]。由表1可知，玉米低聚肽中含有8种必需氨基酸和两种半必需氨基酸(组氨酸和精氨酸)，含量分别为30.24%和2.37%，占氨基酸总和的36.28%，具有较高的营养价值。谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸含量较高，总含量为46.52%，而赖氨酸与色氨酸含量较低，总含量仅为0.48%。氨基酸组成不平衡，这与文献报道一致[1-2]。

玉米低聚肽的抗氧化活性与其氨基酸组成特点有一定的相关性。研究表明，许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸等[13-15]。玉米低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量较高。Kong等[16]的研究表明玉米肽具有明显的自由基淬灭能力和还原能力，这与其富含亮氨酸等具有较强金属离子螯合能力的氨基酸有关。

2.3 玉米低聚肽的相对分子质量分布

表2 玉米低聚肽的相对分子质量分布Table 2 Molecular weight distribution of COP

实验所得分子质量标准曲线方程为：lgMW＝6.914367－0.203034t，R2＝0.999。由表2可知，玉米低聚肽为小分子肽段混合物，相对分子质量小于1000的组分高达93.05%，主要分布在576～132范围内，研究表明，肽的抗氧化活性与相对分子质量大小有关，活性较强抗氧化肽相对分子质量均较小，氨基酸残基的数目一般在20个以内[17]。因此，玉米低聚肽是一种具有潜力的抗氧化性物质。

2.4 玉米低聚肽对DPPH自由基清除能力

DPPH法是评价抗氧化剂清除自由基能力的常用方法，能比较全面地评价抗氧化活性[18-19]。由图1可知，在质量浓度为0～25mg/mL范围内，玉米低聚肽对DPPH自由基清除率与质量浓度呈明显的剂量关系，质量浓度为5mg/mL时，清除率为92.06%，随后清除率几乎保持不变，半抑制浓度(IC50值)为1.9mg/mL。抗坏血酸在极低质量浓度时就表现出很高的清除率，IC50值为4.2μg/mL，可见同等质量浓度条件下，抗坏血酸清除DPPH自由基的能力约是玉米低聚肽的452倍。但是与相关报道的玉米肽相比，如李丹等[12]考察的玉米低聚肽对DPPH自由基的IC50值为29.48mg/mL，可见玉米低聚肽的抗氧化能力还是比较高的。

图1 玉米低聚肽及抗坏血酸对DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of COP and VC on DPPH free radicals

2.5 玉米低聚肽对羟自由基清除能力

图2 玉米低聚肽及抗坏血酸对羟自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of COP and VC on hydroxyl free radicals

羟自由基(·OH)是对人体毒性最大的自由基，常作为判断待测物是否具有抗氧化性的指标。由图2可知，玉米低聚肽具有明显的清除·OH能力，清除率随质量浓度的增大而增强，呈明显的量效关系，IC50值为5.4mg/mL。抗坏血酸的IC50值为0.62mg/mL，同等质量浓度下，其·OH清除率约是玉米低聚肽的8.7倍。玉米低聚肽的清除自由基能力与其可作为供氢体使自由基还原，从而终止自由基连锁反应有关[16]。

2.6 玉米低聚肽对超氧阴离子自由基清除能力

图3 玉米低聚肽及抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of COP on superoxide anion free radicals

超氧阴离子自由基(O2·)是多种自由基的衍生源，是评价物质抗氧化能力的一个重要指标。由图3可见，玉米低聚肽对O2·的清除能力与质量浓度呈现很好的量效关系，IC50值为14.9mg/mL，抗坏血酸的IC50值为0.032mg/mL，可见，玉米低聚肽在清除O2·方面比抗坏血酸要弱得多，同时与前两种自由基清除率相比，也要弱一些。Rajapakse等[20]的研究表明，肽类在清除O2·方面要比清除·OH能力差一些，本实验结果也体现了这一点。这是因为·OH较O2·的氧化能力要强得多，能将所有的有机质氧化，从而玉米低聚肽与·OH作用能够显示出更强的抗氧化能力。

2.7 玉米低聚肽的还原能力

还原能力是抗氧化活力的一个重要指标，吸光度越大表明还原力越大，抗氧化能力就越强[17]。由图4可见，玉米低聚肽和抗坏血酸的吸光度均随着质量浓度的增大而增大，并且吸光度与质量浓度基本成正比关系，拟合方程为y = 0.044x + 0.1052，R2= 0.9991，可知玉米低聚肽的还原能力与其质量浓度成正比，相关研究中也表明了这一点[17,21]。由计算可知，玉米低聚肽在质量浓度为5.0mg/mL时的还原能力与0.02mg/mL的抗坏血酸相当。

图4 玉米低聚肽及抗坏血酸的还原能力Fig.4 Reducing power of COP

与阳性对照抗坏血酸相比，玉米低聚肽的抗氧化能力相对较低，可能由于其成分较为复杂且为初级提纯的工业化产品，因而会影响其抗氧化的能力。在评价玉米低聚肽抗氧化能力的4个指标中，以其清除DPPH自由基能力为最强，考虑到DPPH法的全面、快速和可行性，可以此作为评价玉米低聚肽抗氧化活性的指标。

玉米低聚肽的抗氧化能力与其可作为金属螯合剂、供氢体和自由基稳定剂参与反应有关，因此具有较好的自由基清除能力和还原能力。此外其抗氧化能力与玉米蛋白相比要高得多，可能是玉米蛋白高度致密的结构不利于与自由基产生作用，通过酶解后释放出具有抗氧化活性的小分子肽和游离氨基酸，使参加反应的氨基酸侧链基团暴露，从而自由基清除能力大大提高[12,16]。

3 结 论

玉米低聚肽具有较强的DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力，并且具有一定的还原能力，是一种有效的抗氧化肽。通过对其组成分析，表明玉米低聚肽是小分子肽段混合物，氨基酸组成独特，小分子蛋白质含量很高。许多研究表明，肽的抗氧化性与氨基酸种类和含量以及小肽含量有关，可见，玉米低聚肽的高效抗氧化活性与其抗氧化性氨基酸、小肽和小分子蛋白质含量高有一定相关性。

近年来，功能性低聚肽成为科学研究的一个崭新领域。通过对玉米低聚肽抗氧化活性的研究，为其开发利用提供了实验依据。目前对于玉米低聚肽发挥抗氧化活性的机理和具体功效成分尚不明确，有待深入研究。

参考文献：

[1] 张强, 阚国仕, 陈红漫. 玉米抗氧化肽的分离制备及其体外抗氧化活性的研究[J]. 中国粮油学报, 2005, 20(5): 36-39.

[2] 代衍峰, 何志勇, 陈洁, 等. 抗氧化性玉米肽的分离纯化及其性质[J].食品与机械, 2008, 24(5): 5-8.

[3] 徐力, 刘立, 李相鲁. 玉米功能短肽的制备及其类超氧化物歧化酶活性研究[J]. 中国生化药物杂志, 2002, 23(2): 78-80.

[4] 卫生部食品卫生监督检验所. GB/T 5009.5—2003食品中蛋白质的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

[5] 中国食品发酵工业研究院. GB/T 22729—2008海洋鱼低聚肽粉[S].北京: 中国标准出版社, 2009.

[6] 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所. GB/T 14965—1994食物中氨基酸的测定方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 1994.

[7] 林峰, 马勇, 徐亚光, 等. 基于分子质量分布的食源性低聚肽品质评价[J]. 食品与发酵工业, 2008, 34(9): 128-131.

[8] BYUN H G, LEE J K, PARK H G, et al. Antioxidant peptides isolated from the marine rotifer, Brachionus rotundiformis[J]. Process Biochemistry,2009, 44(8): 842-846.

[9] SMIRNOFF N, CUMBES Q J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemstry, 1989, 28(4): 1057-1060.

[10] 林霖, 田颖刚, 谢明勇, 等. 乌骨鸡活性肽组成成分及体外抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 41-45.

[11] OYAIZU M. Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography[J]. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1988, 35(11): 771-775.

[12] 李丹, 李晓磊, 李荣. 玉米和大豆短肽的自由基清除活性与还原力的对比研究[J]. 食品工业科技, 2008, 29(8): 71-73.

[13] CHEN Huaming, MURAMOTO K, YAMAUCHI F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. J Agric Food Chem, 1995, 43(3): 574-578.

[14] CHEN Huaming, MURAMOTO K, YAMAUCHI F, et al. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein[J]. J Agric Food Chem, 1996, 44(9):2619-2623.

[15] SUETSUNA K, UKEDA H, OCHI H. Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11(3): 128-131.

[16] KONG Baohua, XIONG Y L. Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action[J]. J Agric Food Chem, 2006, 54(16): 6059-6068.

[17] 罗文峰, 吴新亮, 郭勇. 乌骨鸡多肽的体外抗氧化活性研究[J]. 食品科技, 2009, 34(10): 200-204.

[18] TANG Chuanhe, PENG Jing, ZHEN Dawen, et al. Physicochemical and antioxidant properties of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench)protein hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2009, 115(2): 672-678.

[19] PENG Xinyan, XIONG Y L, KONG Baohua. Antioxidant activity of peptide fractions from whey protein hydrolysates as measured by electron spin resonance[J]. Food Chemistry, 2009, 113(1): 196-201.

[20] RAJAPAKSE N, MENDIS E, JUNG W K, et al. Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties[J]. Food Research International, 2005, 38(2): 175-182.

[21] SINGH N, RAJINI P S. Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel[J]. Food Chemistry, 2004, 85(4): 611-616.

Antioxidant Effect of Corn Oligopeptides in vitro

LIU Wen-ying1，LIN Feng2，JIN Zhen-tao1，CHEN Liang1，YI Wei-xue1，CAI Mu-yi1,*(1. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027, China；2. School of Public Health, Peking University, Beijing 100083, China)

On the basis of protein content, amino acid composition and molecular weight distribution of corn oligopeptides(COP), the antioxidant activity of COP in vitro was evaluated by determining the abilities to scavenge DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radicals as well as reducing power. Results indicated that the content of total protein was 89.28%, of which acid soluble proteins accounted for 94.31%; amino acid composition was unique and COP was rich in amino acids such as leucine, proline and alanine with strong antioxidant activity. The major molecular weight of COP was less than 1000 (93.05%),and small peptides with a molecular weight range of 132－576 were dominant. The median inhibitory concentrations (IC50 values) of COP for scavenging DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radicals on the basis of scavenging rate were 1.9,5.4 mg/mL and 14.9 mg/mL, respectively. The reducing power of COP at a concentration of 5.0 mg/mL was similar to that of ascorbic acid at 0.02 mg/mL. The antioxidant activity of COP exhibited a dose-dependent relationship.

corn；oligopeptide；molecular weight distribution；amino acid composition；antioxidant activity

TS213.4；TQ936.16

A

1002-6630(2011)05-0022-05

2010-06-10

国家“863”计划项目(2007AA10Z327)

刘文颖(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为食源性低聚肽。E-mail：wenyingliu888@126.com

*通信作者：蔡木易(1962—)，男，教授级高工，本科，研究方向为功能食品生物技术。E-mail：caimuyi@vip.sina.com