王,郭颖杰,周 慧,李春怀*

(1.吉林大学第一医院、吉林大学儿童血液病诊治中心,吉林长春 130021;2.吉林大学生命科学院）

文献报道6-MP的疗效和毒性与其代谢过程相关酶的基因多态性相关[1],TPMT是6-MP代谢过程的关键酶之一,能特异地催化6-MP甲基化而失活,从而影响其主要活性代谢产物TGNs的形成。为了研究患儿应用6-巯基嘌呤产生严重骨髓抑制的原因,我们对参与 6-MP代谢的巯嘌呤甲基转移酶(TPMT）基因进行了测序和TPMT酶活力测定。

1 材料与方法

1.1 临床资料

患儿,女,3岁,确诊急性淋巴细胞白血病(B细胞型）。按全国小儿白血病协作组化疗方案化疗,诱导缓解化疗达完全缓解,序贯治疗进入维持治疗,应用6-巯基嘌呤(50-75mg/m2/天）实予37.5 mg/天,晚睡前顿服,共21天;甲氨喋呤(20-40 mg/m2/次）实予12.5 mg/次,每周1次共3次。第1次维持用药应用6-巯基嘌呤即37.5 mg/天晚睡前顿服10天后外周血常规下降明显,出现IV级骨髓的抑制,外周血WBC 0.7×109/L;RBC 1.62×1012;Hb 47 g/L;PLT 7×109。停用6-巯基嘌呤后,血常规恢复正常。第2次维持用药将6-巯基嘌呤每天的剂量减至7mg维持用药后,骨髓的抑制程度减轻,外周血常规WBC 2.1×109/L;RBC 2.62×1012;Hb 77 g/L;PLT 91×109。以上临床资料表明,此患者应用常规剂量的6-MP后出现严重的骨髓抑制,将剂量减至原来的1/5以上,仍有比较明显的骨髓抑制。

1.2 试剂

全血基因组DNA纯化试剂盒购自华美公司;Taq DNA聚合酶、dNTP购自宝生物工程大连有限公司;各种引物的定购和测序都有上海生工生物技术服务有限公司完成;S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM）、6-甲基-巯基嘌呤(6-MMP）、别嘌醇(Allopurinol）均购自Sigma公司。

1.3 全血DNA的抽提

取患者冷冻保存的肝素抗凝血1ml,用全血基因组DNA纯化试剂盒从中提取全基因组DNA,于-20℃保存。

1.4 TPMT基因的全测序

TPMT基因位于染色体6p 22.3上,全长为34 kb,包括10个外显子和9个内含子。具体步骤以全基因组DNA为模板1 μ l,分别加入dNTP(10 mmol/L）1 μ l、10×buffer 5 μ l、加入上下游引物 20 pmol(表1）各 0.75 μ l,Taq E 0.5 μ l,补充三蒸水至终体积为50 μ l,混匀。PCR条件为:变性94 ℃45 s,引物各自的退火温度40 s,延伸72℃30 s,循环35轮。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,并委托上海生物工程有限公司对其进行测序。表1列举了用PCR法扩增TPMT各外显子的引物序列,引物位置和扩增片断的大小。

1.5 TPMT酶活的测定

TPMT酶活性测定方法:以S-腺苷-L-甲硫氨酸为特异性的甲基供体,催化6-巯基嘌呤生成6-甲基-巯基嘌呤。

将新鲜全血放于15ml离心管中800 g,4℃离心15 min,红细胞沉淀用0.9%冰冷生理盐水洗三次(800 g,4℃离心15 min）,加入等体积冷水于4℃裂解20 min,12 000 g、4℃离心1 0min,吸取上清冻存于-80℃保存。取3 ml红细胞裂解液,慢慢融化,加入1/10体积的chelex100,移走Mg2+离子,在4℃轻摇 1小时,2 800 g在4℃离心5分钟,吸取上清液。在上清液1 ml中分别加入253 μ l、150 mM磷酸钾缓冲液(pH7.5）、终浓度 1 mM DTT 、58 μ M 别嘌醇 、29 μ M SAM和7.2 mM 6-巯基嘌呤至总体积1.5 ml,在37℃水浴摇1.5小时,直接冻存于-80℃中止反应。在0.75 ml上述反应液中加入0.875 ml(Methanol:0.1N HCl）,于4℃5 000 g离心 5 min,重复一次。用0.45 μ M或0.22 μ M 的水膜过滤样品,进行HPLC检测。色谱柱为SB-300A C18(安捷伦公司生产）。洗脱条件为流动相:A:甲醇;B:水,用醋酸调pH值至2.9,流速:A:0.12 ml/min;B:0.79 ml/min,在290 nm有UV吸收。该方法的标准曲线线性范围为25～2 000 μ g◦L-1(r＞0.998）。

表1 用于TPMT测序的引物的序列和位置

2 结果

2.1 TPMT基因的全测序的结果

根据NCBI中TPMT的基因序列(NC-000006）,采用内含子特异性结合的引物,扩增TPMT基因的每个外显子及外显子和内含子连接部位。测序的结果表明TPMT基因序列中存在三处突变(如图1所示）,包括内含子4的C7355T;内含子5的T 11606C;外显子7的C16161T无意义突变。

图1 TPMT基因的核苷酸顺序。A为内含子4的C7355T突变;B为内含子5的 T 11606C突变;C为外显子7的C16161T无意义突变。

2.2 TPMT酶活力的测定结果

为了验证患者TPMT基因序列中的两处内含子突变是否影响TPMT基因的剪切,从而影响转录,蛋白含量和酶的活力,我们通过HPLC方法测定患者新鲜血液中TPMT酶活力。如图2所示6-MP和 6-MMP的出峰时间分别13 min和34 min。通过标准曲线求算得到TPMT酶活力为15 nmol/h/ml PRBC,属于TPMT高活性者。

图2 通过HPLC方法检测6-MP的代谢产物6-MMP含量

3 讨论

6-MP是治疗儿童急性淋巴细胞白血病最为广泛的药物之一。其主要作用机制是6-巯基嘌呤在细胞内通过合成代谢转化为一系列6-硫鸟嘌呤核苷(6-thioguanine nucleotides,TGNs）的代谢产物,TGNs作为鸟嘌呤核苷的拮抗剂参入DNA和RNA分子,进而通过抑制DNA的复制和RNA的表达而发挥细胞毒作用。6-MP常与甲氨喋呤,长春新碱和强的松一起作为缓解ALL后的维持治疗药物,其中6-MP有不同程度的骨髓抑制,但是绝大多数患儿调整药量后基本可以耐受不良反应,而同时间应用的小剂量甲氨喋呤口服对骨髓抑制作用不明显。

本例ALL患儿在化疗过程中服用常规剂量的6-MP出现了IV级的骨髓抑制,剂量下降至原来的1/5恢复正常,表明这是一名6-MP不耐受患者。文献报道[1]6-MP的疗效和毒性与其代谢过程相关酶TPMT的基因多态性相关。对于TPMT基因突变导致酶缺陷的病人,使用常规剂量的6-MP,也会导致体内巯基鸟嘌呤磷酸盐的积累,产生严重的毒性,如严重的骨髓抑制和肝损害等,最终导致治疗的被迫中断,造成治疗失败[2,3]。常见的TPMT基因突变包括第5外显子G238C、第7外显子G469A和第10外显子A719G,它们的突变均与酶活性减低有关。

为了探究6-MP导致此患者骨髓抑制的原因是否与TPMT基因突变有关,我们对这名患者TPMT基因进行了全测序。测序的结果表明TPMT基因序列中存在三处突变,包括内含子两处和一处外显子无意义突变。为了阐明内含子突变是否影响患者的酶活力,我们通过高效液相色谱法检测红细胞中TPMT活性。文献[4]报道高活性的TPMT的酶活为10-25 nmol/h/ml packed red blood cells(PRBC）,中低活性TPMT的酶活为＜10nmol/h/ml PRBC。我们的结果显示这名6-MP不耐受患者的TPMT活性为15nmol/h/ml PRBC,属于TPMT高活性者,这与TPMT测序结果中未发现外显子的有意义突变相一致,也说明内含子的突变不影响TPMT的酶活力,其骨髓抑制与TPMT酶缺陷无关。

以上研究结果表明这名6-MP不耐受者与TPMT的基因多态性无关,说明TPMT的基因多态性不能完全解释6-MP的毒性作用,由于内外环境因素都可能影响机体对药物的敏感性,机体对药物反应的差异还需要多因素的共同分析。

[1]Palmieri O,Latiano A,Bossa F et al.Sequential evaluation of thiopurine methyltransferase,inosine triphosphate pyrophosphatase,and HPRT1 genes polymorphisms to explain thiopurines'toxicity and efficacy[J].Aliment Pharmacol Ther,2007,26(5）:737.

[2]Relling MV,Hancock ML,Boyett JM et al.Prognostic importance of 6-mercaptopurine dose intensity in acute lymphoblastic leukemia[J].Blood,1999,93(9）:2817.

[3]McLeod HL,Relling MV,Liu Q et al.Polymorphic thiopurine methyltransferase in erythrocytes is indicative of activity in leukemic blasts from children with acute lymphoblastic leukemia[J].Blood,1995,85(7）:1897.

[4]Nishida A,Kubota T,Yamada Y et al.Thiopurine S-methyltransferase activity in Japanese subjects:metabolic activity of 6-mercaptopurine 6-methylation in different TPMT genotypes[J].Clin Chim Acta,2002,323(1-2）:147.