何希瑞，李茂星，尚小飞，贾正平，张汝学(.兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050;2.兰州大学，甘肃 兰州 730000)

龙胆科龙胆属植物全世界约有400余种，中国有247种，分布遍及全国［1］。龙胆属植物作为中国的传统药用植物具有多种药理活性。秦艽G.crassicaulis，具有祛风除湿、活血舒筋、清热利尿作用，治疗风湿、痹痛、筋骨拘挛［2］;龙胆G.scabra具有泻肝胆实火、清下焦湿热等功效，用于治疗肝经热盛、惊厥狂躁、黄疸等疾病［2］。环烯醚萜苷及其衍生物是秦艽和龙胆植物的主要化学成分。龙胆苦苷作为重要的有活性的环烯醚萜苷成分，具有显著地保肝、抗炎、抗菌等生物活性［3～5］。秦艽药材富含油性并具有一定的芳香气味，这一特性也常用于鉴定药材的品质。但对秦艽和龙胆的挥发油成分及其抗炎活性研究分至今未见报道。本研究采用超临界流体萃取法(SFE-CO2)提取了秦艽和龙胆的挥发油;用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析和鉴定了挥发油的化学成分;并采用体内体外炎症实验模型研究两种挥发油的抗炎活性。

1 材料与仪器

1.1 实验药物 粗茎秦艽G.crassicaulis于2008年8月份采自青藏草原;龙胆G.scabra药材购自甘肃中医学院附属医院，两药材均经兰州大学药学院马志刚教授鉴定，符合中国药典药用标准。

1.2 细胞株与动物 巨噬细胞RAW264.7由第二军医大学惠赠;清洁级昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量22～24 g，兰州生物制品研究所提供。

1.3 主要试剂 DMEM高糖培养基，Lipopolysac-charide(LPS)，四甲基偶氮唑蓝 (MTT)，Griess reagent和胰酶购自美国Sigma公司;小牛血清购自杭州四季青公司;其它试剂均为分析纯。

1.4 主要仪器 Speed SFE型超临界萃取仪(美国)，HP-GC-6890N-5973型GC-MS联用仪(美国)，CO2细胞培养箱(美国Forma Scientific公司)，OLMPUS IMT-2倒置显微镜(日本OLMPUS公司)，Multiskan MK3酶标仪(美国)，BP210S电子天平(赛多利斯有限公司)。

2 方法

2.1 挥发油提取 超临界CO2萃取(SFE-CO2)法操作流程:CO2气瓶→冷却系统→高压泵→萃取釜→分离釜→循环。将粉碎粒度为40目的秦艽、龙胆药材投入0.5 L萃取釜中，萃取釜压力20 Mpa，温度45～50℃，萃取120 min后收集提取物。称重后低温保存，所得挥发油为浅黄色透明油状物，具有芳香味。

2.2 气相色谱-质谱分析条件 色谱条件:Agilent DB-5MS(50 m ×0.25 mm ×0.25μm);色谱柱程序升温条件:起始温度40℃，以3℃/min的速率升温至260℃并保温10 min，载气He。分流比10∶1，分流流量:9.9 ml/min，省气流量:20.0 ml/min，进样量1.0 μl。质谱条件:离子源电压 70 eV，质量分析器温度150℃，离子源温度230℃;离子扫描范围为30～550 m/z。取SFE-CO2法得到的秦艽、龙胆挥发油(简写 GCEO、GSEO)进行 GC-MS检测，解析质谱，用面积归一化法确定各成分的相对含量。

2.3 细胞培养及分组 小鼠巨噬细胞RAW264.7加入含10%的胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、链霉素的无酚红DMEM高糖培养基置于5%CO2，37℃培养箱中生长。细胞生长至70%～80%融合后进行传代。调整细胞浓度为1×105cells/well，接种于96孔培养板，每孔200 μl。按实验要求将细胞分为正常对照组:常规DMEM培养;LPS组:10 μg/ml LPS;GCEO+LPS组:GSEO+LPS组;铺板24 h后弃掉培养液，加入新的培养液及药物和LPS(10 μg/ml)。置37℃，5%CO2培养箱中继续培养24 h。每个实验组设6个复孔，所有实验均重复3次。

2.4 细胞活性的测定 调整细胞悬液浓度为1×105cells/well，加入 96 孔培养板内，每孔 200 μl，置37 ℃，5%CO2孵箱培养24 h 后，分别加入6、30 μg/ml的秦艽、龙胆挥发油 (对照组加正常培养液)，每组均设6个复孔。继续培养24 h，弃去上清液后，每孔加入180 μl新鲜 DMEM 培养液，再加入 20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h。终止培养，小心弃去孔内培养液。每孔加入100 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解［6］，用酶标仪测定570 nm处吸光值。

2.5 NO含量测定 将对数生长期的细胞用胰酶消化后，调制成浓度为1×105cells/well的细胞液，每孔200 μl接种于96孔板。培养24 h后加入秦艽、龙胆挥发油至终质量浓度为 6、30 μg/ml，并加入50μl的10 μg/ml LPS;同时设立正常对照组和模型组，每组设6个平行孔，继续培养24 h。收集各处理组培养细胞的上清液 100 μl，加入 100 μl Griess reagent试剂，室温放置 10 min［7，8］。然后用酶标仪测定570 nm处各孔的吸光值。

2.6 二甲苯致耳肿胀试验 清洁级昆明种小鼠60只，雌雄各半。参照相关研究方法［9］，按体重随机分为6组，秦艽、龙胆挥发油高剂量组120 mg/kg，低剂量组60 mg/kg，阳性对照组(地塞米松10 mg/kg，DEX)及空白组(生理盐水0.1 ml/g)。各组均腹腔注射给药30 min后分别将30 μl二甲苯涂于小鼠右耳正反两面，左耳不涂作为对照，1 h后处死小鼠。用直径6 mm打孔器打下左右耳，称重，左耳做对照，以左右耳片重量差作为肿胀度。计算肿胀抑制百分率。

2.7 统计学处理 数据用“均数±标准差”表示，采用SPSS 13.0统计软件对试验结果进行ANOVA方差分析，检验分析不同组之间数据的差异显著性。

3 结果

3.1 秦艽、龙胆挥发油化学成分的鉴定 按照上述实验条件，进行GC-MS分析，得到秦艽、龙胆挥发油在Agilent DB-5MS柱上的总离子流程图，图1、图2。

本实验采用计算机对各峰质谱图进行NIST标准谱库检索，根据质谱裂解规律进行核对，并参考标准图谱确定其化学成分，用峰面积归一化法计算各组分的质量分数。本实验首次从秦艽和龙胆挥发性成分中鉴定出29个和40个化合物，定性结果和质量分数见表1、表2。

表1 秦艽挥发油的化学成分

3.2 秦艽、龙胆挥发油对RAW264.7细胞生长的影响 MTT比色法测定结果显示6、30 μg/ml秦艽和龙胆挥发油均没有表现出对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。证明在实验设置的药物剂量下，秦艽、龙胆挥发油并没有细胞毒性，实验可行，结果如图3所示。

表2 龙胆挥发油的化学成分

3.3 秦艽、龙胆挥发油对RAW264.7细胞NO释放的影响 试验结果如图4所示，与空白对照组比较，模型组NO释放量显著增高，表示模型建立成功。与模型对照组相比较，6、30 μg/ml秦艽和龙胆挥发油均能明显抑制巨噬细胞RAW264.7的NO释放量。其中，以30 μg/ml的秦艽、龙胆挥发油抑制作用最为显著，抑制率分别达到56.3%、54.2%，提示秦艽、龙胆挥发油体外显示了很好的抗炎活性。

3.4 秦艽、龙胆挥发油对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 由表3可知，不同浓度的秦艽、龙胆挥发油高、低剂量组的耳重差与模型组比较，差异具有显著地统计学意义。说明秦艽、龙胆挥发油均能有效抑制由二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，显示了较强的抗炎活性。

表3 秦艽、龙胆挥发油对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(n=10)

4 讨论

4.2 由表1、2可知，从秦艽和龙胆挥发油中分别鉴定出29个和40个化学成分，但各自成分差异很大。粗茎秦艽富含(2e，4e)-2，4-decadienal(14.02%)，1-methyl-4-(1-methylethenyl)-benzene(12.69%)和 methyl-1，2-dihydro-2-oxo-quinoline-4-carboxylate(7.86%);而龙胆根中挥发油的主要成分是 n-hexadecanoic acid(16.50%)，hexanoic acid(9.11%)，diisobutyl phthalate(5.48%)，heneicosane(5.24%)和 octanoic acid(5.05%)。另外，从秦艽、龙胆挥发油中均鉴定出hexanal，1-octen-3-ol，heneicosane 和 1，7，7-trimethyl-(1R)-bicyclo［2.2.1］heptan-2-one等低极性成分。结合图 1、图2，秦艽所含挥发油成分富含醛、酚类成分，具有较短的保留时间和较小的分子量，而龙胆则富含脂肪酸类成分，保留时间相对较长，分子量较大。显然，正是这种高含量的醛、酚类成分的存在而使得秦艽的根具有比龙胆更浓郁的香味。

4.2 NO被认为是病理过程中的介质和调节剂，特别是在急性炎症应答中，少量的NO对体内稳态起着重要的调节作用，然而病理情况下诱导型NO合成酶合成大量的NO则有细胞毒作用，其可加重炎症反应并有致癌作用。因此，测定RAW264.7细胞释放NO含量对评价秦艽、龙胆挥发油抗炎活性具有重要意义。如图4所示，秦艽、龙胆挥发油均表现出对巨噬细胞NO生成的抑制作用，且抑制能力随浓度增大而提高，显示出一定的剂量依赖性。当浓度为30 μg/ml时，秦艽、龙胆对RAW264.7细胞NO生成的抑制率分别为56.3%、54.2%。其机制可能是通过抑制NO合成酶活性而发挥抗炎作用的。另外，作者考察了挥发油的体内抗炎活性，实验以小鼠耳廓肿胀模型考察了秦艽、龙胆挥发油的体内抗炎药理学活性。结果表明，秦艽和龙胆挥发油均能够明显对抗由二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，且呈现剂量依赖性。

4.3 本实验表明秦艽和龙胆的挥发油在体内、体外均显示了显著的抗炎活性 2，4-decadienal，作为秦艽挥发油的主要成分，据报道能有效抑制TNF-α mRNA的基因表达而发挥抗炎作用(5 μM，46%，P＜0.001)［10］;秦艽和龙胆挥发油中所含的另一个化合物hexanal，在200 μM 的剂量下同样抑制 TNF-α mRNA 的基因表达(23%，P ＜ 0.001)［7］;n-hexadecanoic acid，作为龙胆挥发油的主要组成成分，据报道其具有免疫应答作用，可以调节感染损伤后的炎症。同时，据报道地龙挥发油的主要成分肉豆蔻酸(17.5%)和 n-hexadecanoic acid(16.9%)在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型中显示出良好的抗炎活性，且其抗炎能力与脂肪酸类成分的含量高低密切相关［11］。因此，作者推断秦艽、龙胆挥发油的抗炎作用归因于此类醛和酸类成分的存在。另外，龙胆苦苷一直被认为是秦艽、龙胆药材的主要抗炎活性成分，据报道，300、150和50mg/kg龙胆苦苷皮下注射给药可显著抑制二甲苯引起的鼠耳肿胀，抑制率分别是56.3%，39.2% 和 14.5%［4］，而本实验发现 120 mg/kg秦艽、龙胆挥发油在小鼠肿胀实验模型中同样表现出显著地抗炎活性，抑制率分别达到37.2% 和37.8%。可见，龙胆苦苷和挥发油成分在秦艽、龙胆药材的抗炎活性中均扮演着很重要的角色，因此挥发油也应该得到重视以便更好的控制药材质量。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1988:62.

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［11］肖寄平，张炜煜.脂肪酸在地龙抗炎作用研究中的指示作用［J/OL］，长春中医药大学，中医中药网.