胡华军，萨晓婴，应华忠，刘 军，冯丁丁，殷楠楠

（1.中国计量学院 生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.浙江省医学科学院 实验动物中心，浙江 杭州 310013；3.浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江 杭州 310018）

T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白1（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，TIM－1），是一种I型跨膜蛋白，由N末端免疫球蛋白可变区样结构域（IgV）、黏蛋白样结构域、跨膜区和一个带有磷酸化基序的胞质尾区构成［1］.TIM－1表达于活化的初始T细胞、Th2细胞、肥大细胞、NTK细胞表面，作为受体蛋白与天然内源性配体TIM－1、TIM－4、磷脂酰丝氨酸（PtdSer）、IgA、白细胞单型免疫球蛋白样受体5（LMIR5／C300b）等相互作用，为细胞活化提供协同刺激信号，促进相关细胞因子分泌，介导对凋亡细胞的吞噬和清除［2］.尤其Tim－1对Th2细胞的偏向性作用直接影响过敏性疾病的发生与发展.另外，由于Tim－1最早是作为甲型肝炎病毒（HAV）感染细胞的结合受体而被发现的，又称HAVcr－1.在流行病学研究中，McIntire等发现人类TIM－1基因157insMTTTVP型个体感染HAV后可降低患过敏性疾病风险［3］.而随后研究者们相继对不同国家人群TIM－1基因外显子4及启动子区位点的变异与类风湿关节炎、过敏性湿疹、哮喘等疾病进行相关性研究，但结论不一，其原因可能是各地人群受遗传背景、生活环境、HAV感染几率等不同因素的影响［4］.因此 HAV、Tim－1、哮喘等过敏性疾病的功能联系有待深入研究，但目前还缺乏理想的实验动物模型.长爪沙鼠又称沙土鼠（Meriones unguiculatus）、蒙古沙鼠（Mongolian gerbils），隶属啮齿目，仓鼠科，沙鼠亚科，沙鼠属，是一种正在被开发的“多功能实验动物”［5］.本研究目的在于获得长爪沙鼠Tim－1基因编码区部分序列，并建立荧光定量PCR方法检测Tim－1基因在不同组织中表达情况.

1 材料与方法

1.1 材料

TRIzol试剂购自Invitrogen公司；Pyrobest DNA Polymerase、M－MLV 逆转录酶、SYBGreen荧光试剂盒、RNase Inhibitor和pMD18－T载体购自宝生物工程公司；E.coli DH5α感受态为本实验室保存；引物由上海生物工程公司合成，引物序列见表1.ZCLA长爪沙鼠（6－8周龄雄性），由浙江省医学科学院实验动物中心提供［SCXK（浙）2003－0002］，采集的肌肉、心脏、小肠、脾脏、肝脏、肺、肾脏组织冻存于液氮中.

1.2 长爪沙鼠各组织总RNA的提取与cDNA的合成

手术剪准确剪取ZCLA长爪沙鼠肌肉、心脏、小肠、脾脏、肝脏、肺、肾脏7个不同组织，生理盐水洗净后用TRIzol试剂提取各组织总RNA，分光光度计检测其OD值，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，按M－MLV逆转录酶说明书反转录合成cDNA.存于－70℃备用.

1.3 PCR及产物的克隆与测序

根据对GenBank中小鼠的 Tim－1（NM＿001166631）、大鼠的Tim－1（NM＿173149.1）的序列分析，我们设计合成了长爪沙鼠Tim－1的一个正向简并引物（gTIM－1－F1）和两个反向简并引物（gTIM－1－R1、gTIM－1－R2）（表1）.将合成的cDNA为模板，利用gTIM－1－F1、gTIM－1－R1为外侧引物，gTIM－1－F1、gTIM－1－R2为内侧引物进行半巢式PCR扩增长爪沙鼠Tim－1的同源片段.两轮PCR反应条件如下：94℃预变性4min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共34个循环；最后72℃延伸2min.将获得的第二轮PCR产物切胶回收，连入pMD18－T载体，转化E.coli DH5α感受态，PCR法筛选阳性菌株，将筛选菌株送上海英骏生物技术有限公司进行测序.

表1 Tim－1基因克隆的PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences for cloning of Tim－1gene.

1.4 实时荧光定量PCR检测长爪沙鼠Tim－1基因的不同组织中表达

采用荧光定量PCR检测长爪沙鼠Tim－1基因在肌肉、心脏、小肠、脾脏、肝脏、肺、肾脏组织中的表达情况.根据所克隆的长爪沙鼠Tim－1的基因片段序列设计引物gTIM－1－P1、gTIM－1－P2（表1），根据GenBank中报道的长爪沙鼠β－肌动蛋白（ACTIN－β，AB177844.1）保守序列设计内参引物gACTIN－β－P3、gACTIN－β－P4（表1）.将提取各组织总RNA进行逆转录反应后，采用SYBGreen染料法进行Real－Time PCR反应，PCR条件：95℃10s预变性；95℃变性，5s，60℃25s退火／延伸（收集荧光信号），45循环，在55－95℃之间制备融解曲线确定Tim－1基因扩增特异性.内参基因ACTIN－β和目的基因Tim－1在同一条件下不同管内扩增，试验对每个样品进行3个技术重复，最后取平均值.采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量.并将长爪沙鼠脾脏组织定义为对照，分析其他组织相对脾脏组织的Tim－1表达水平差异.

2 结 果

2.1 长爪沙鼠Tim－1基因片段克隆与序列比对

设计的Tim－1基因引物在长爪沙鼠肾组织中得到了较好的扩增（图1），测序发现Tim－1基因扩增片段为243bp，序列同源比对分析发现该片段与小鼠、大鼠Tim－1基因相似性（similarity）达80%以上，推断所获得的cDNA为Tim－1基因的部分片段（图2）.该序列已提交到GenBank，登录号为JN628997.

图1 Tim－1基因部分片段的PCR产物电泳结果图Figure 1 PCR amplification of Tim－1gene

图2 长爪沙鼠Tim－1基因克隆片段与小鼠、大鼠Tim－1基因序列的同源性比较Figure 2 Homology comparison of Tim－1sequences in Meriones unguiculatus，mouse and rat

2.2 荧光定量PCR扩增产物特异性

对样品Tim－1基因的扩增产物在55～95℃进行了融解曲线分析，每隔0.2℃读板1次.根据对原始曲线（图3a）和融解曲线（图3b）分析得Tm值为81.8℃，融解曲线都为单峰，说明所设计的引物扩增效果特异性好.

2.3 长爪沙鼠不同组织Tim－1基因mRNA表达的比较

图3 Tim－1基因的熔解曲线Figure 3 Melting curve of Tim－1gene

每一组织样品均使用β－肌动蛋白基因作为内参照，并定义在长爪沙鼠脾脏组织中的表达水平为1，以对Tim－1基因在其它组织样品中的表达水平进行相对定量.研究结果发现（图4），Tim－1基因在长爪沙鼠肌肉、心脏、小肠、脾脏、肝脏、肺、肾脏组织中表达具有差异性，在肾脏组织中表达水平高于其他组织，在小肠、脾脏、肺组织中表达较低，在肌肉、心脏和肝组织中表达更低.

图4 Tim－1mRNA在长爪沙鼠不同组织中表达Figure 4 Expression of Tim－1mRNA in different tissues of Meriones unguiculatus

3 讨 论

目前对于哮喘等过敏性疾病的研究往往通过建立与人类似症状的动物模型来进行.已开展的哮喘动物模型种类较多，包括猴、马、猪、猫、犬、羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠，其中鼠类应用最普遍，但都有不足之处［6，7］.如豚鼠虽易被致敏，能产生I型变态反应，反应程度强于其他动物，但个体差异较大，且其变态反应更多由IgG而非IgE介导，这与人类的有所不同，且试验中死亡率较高［6］；大鼠、小鼠虽然遗传背景较为清楚，制作哮喘模型时死亡率低，但临床指征不明显；小鼠由于体积小，操作不便，也易造成非哮喘性气道阻力增高［7］.同时还因为小鼠对HAV不易感，不适用于研究人类哮喘与HAV关系的动物模型［8］.此外，对于猫、兔、羊、猪、犬、猴等用于制作哮喘模型时同样有不足，加之价格较昂贵也限制了其应用.因此有必要寻找新动物模型用于HAV、TIM－1及哮喘等过敏性疾病互作关系的研究.长爪沙鼠曾是研究流行性出血热病毒（EHFV）特性和研制流行性出血热疫苗的首选实验动物［9］；也是研究脂类代谢、丝虫病与线虫病等寄生虫病、糖尿病、自发性癫痫等的理想动物模型.随着现代医学的飞速发展，长爪沙鼠被广泛地用于药理学、血清学和细菌学、内分泌学、行为学等研究领域［10］.本研究中我们首次克隆获得了长爪沙鼠Tim－1基因部分片段，并检测出不同组织转录表达特征，从而为克隆长爪沙鼠Tim－1基因全长cDNA序列及探讨建立与TIM－1功能关联动物模型的研究提供了遗传背景方面信息.

［1］MCINTIRE J J，UMETSU S E，AKBARI O，et al.Identification of Tapr an airway hyperreactivity regulatory locus and the linked Tim gene family［J］.Nat Immunol，2001，2（12）：1109－1116.

［2］RENNERT P D.Novel roles for TIM－1in immunity and infection［J］.Immunol Lett，2011，8：3.

［3］RENNERT P D.Novel roles for TIM－1in immunity and infection［EB／OL］.（2011－09－02）［2011－10－20］.http：／／www.sciencedirect.com／science／article／pii／S0165247811002203.

［4］MCINTIRE J J，UMETSU S E，MACAUBAS C，et al.Immunology：hepatitis A virus link to atopic disease［J］.Nature，2003，425（6958）：576.

［5］武其文，胡丽华.Tim－1分子的结构、功能及多态性研究进展［J］.现代免疫学，2008，28（5）：420－424.

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［11］丁贤明，钱宝珍.长爪沙鼠在生物医学中的应用及其生理生化研究进展［J］.中国比较医学杂志，2006，16（5）：313－318.