孟庆翔 谢景华 高雄辉 李 明 王 磊 李 鹏

喉癌是头颈部常见的上皮源性恶性肿瘤，目前临床治疗以根治性手术结合术前或术后辅助性放疗为主，但疗效评价缺乏客观、敏感、特异的检测指标。喉癌致死的主要原因是复发和转移，而上皮性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就可能有癌细胞入侵，进入血液的癌细胞可表达多种上皮性特异性蛋白。巢式RTPCR可在1×107个单核细胞中检出1～10个肿瘤细胞，敏感性、特异性远远高于其他方法［1］。本研究通过巢式RT-PCR法检测喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA临床治疗前后的表达情况，结合临床资料综合分析，以期为喉癌局部复发的预测、指导临床治疗提供依据。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选择2006年1月至2007年12月我院收治的喉癌患者48例，均为男性，年龄44～79岁，中位年龄56岁。48例患者中:声门型34例，声门上型14例;T1N0M012例，T2N0M09例，T3N0M012例，T3N1M08例，T4N0M02例，T4N1M05例。临床分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期27例，术前临床诊断淋巴结转移13例。所有病例术前经病理确诊为鳞状细胞癌。

1.2 治疗方案

48例患者全部接受手术治疗，其中喉部分切除21例，全喉切除27例，行颈淋巴结清扫14例，术后行辅助性放疗19例，放疗计量50Gy。分别于术前和术后6、12、24个月抽取患者外周静脉血。另抽取10例声带息肉患者为阴性对照，10例喉癌组织为阳性对照。

1.3 随访结果

术后随访24个月，其中1例Ⅳ期患者术后24个月失访。4例复发:颈部淋巴结复发3例(术后13、18和21个月，均为Ⅳ期);气管造漏口周围复发1例(术后21个月，Ⅳ期)，所有局部复发病例都经病理证实并接受进一步治疗，无死亡病例。

1.4 主要试剂

淋巴细胞分离液、Trizol、逆转录试剂盒、Taq酶、DEPC(上海生工生物工程公司)、Taq、dNTP(美国MBI公司)、DNaseⅠ、RNase(大连宝生物技术有限公司)、水饱和酚、氯仿、异丙醇均为国产分析纯，实验室试剂以无菌去离子水配制，用于RNA提取试剂及器皿均以0.05%DEPC处理;引物设计参照文献［2～4］，引物由上海申友生物公司合成，引物序列为:CK19-A: 5'-GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3';CK19-B:5'-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCAG-3'CK19-C:5'-CGAGCAGAACCGGAA-3';CK19-D:5'-TGAGCCGCTGGTACTCCTGAT-3';CK20-A:5'-CAGACACACGGTGAACTATGG-3';CK20-B:5'-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3';CK20-C:5'-CTGTTTGTTGGCAATGAGAAAATGG-3';CK20-D:5'-GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT-3';β-actin同义链:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3';βactin 反义链:5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'。

1.5 方法

1.5.1 总RNA提取 取患者术前外周静脉血3～5ml，枸橼酸钠抗凝，2h分离外周血单个核细胞(the peripheral blood mononuclear cells，PBMNC);肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。一步法(Trizol)提取细胞和组织的总RNA，-80℃保存待用(无RNA酶的DNaseⅠ去除混杂的DNA)。取5μl总RNA电泳观察28S和18S亮带，鉴定RNA提取质量，分光光度计定量。以OD260/OD280为1.7～2.0及电泳带28S∶18S约2∶1，表明所提取的RNA符合要求。

1.5.2 取1～2μg细胞总 RNA，70℃ 6min变性后，根据Takara RNA试剂盒进行cDNA第1链合成。各取5μl逆转录产物行第1轮PCR，第1轮PCR反应产物 0.5μl行第 2轮 PCR，另有 10×PCR Buffer、dNTP及MgCl2等，反应总体积均为25μl。CK19扩增的第1轮PCR引物为A和B，反应条件:94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环40 次;第2轮引物为 C和 D，退火温度为52℃，余同第1轮。CK20扩增的第1轮PCR引物为A和B，反应条件:94℃变性 30s，63℃退火 1min，72℃延伸 30s，循环 35次;第2轮引物为C和D，退火温度为62℃，余同第1轮。β-actin循环条件为 95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环 35 次，72℃延伸 10min。

1.5.3 结果观察 取5μl第2轮PCR产物以1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在1×TBE缓冲液里，100V，30min。紫外灯下观察并拍照，在 303、319、及531 bp处出现肉眼可见条带判为阳性。

1.6 统计分析

用SPSS 11.0软件包分析各组数据，采用χ2检验或Fisher确切概率法对病例数据进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者外周血组、阳性对照组与阴性对照组CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达情况

48例喉癌患者外周血CK19 mRNA阳性18例，CK20 mRNA阳性22例，两者均阳性11例，两者均阴性者8例。10例喉癌组织CK19 mRNA阳性10例，CK20 mRNA阳性9例。10例阴性对照CK19 mRNA阳性1例;CK20 mRNA阳性0例。实验组及对照组β-actin均表达。外周血组及阳性对照组与阴性对照组比较，阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA治疗前后的表达情况

喉癌患者(除随访24个月内1例失访，4例复发)术前CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达显著高于术后6、12、24个月，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA治疗前后的表达情况

2.3 术前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达与喉癌复发的关系

47例患者(1例失访)根据术后24个月内肿瘤局部复发与否分为复发组与无复发组。复发组术前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达均为75%(3/4)，无复发组术前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达分别为34.5%(15/43)和44.2%(19/43)，复发组术前CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达高于无复发组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。复发组术后6、12个月外周血 CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达与术前比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 喉癌患者复发组与无复发组术前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达情况

3 讨论

癌细胞在外周血中的微转移是肿瘤复发和转移的重要起始步骤。喉癌属上皮源性恶性肿瘤，其复发与转移是影响其远期疗效的重要因素。细胞角蛋白(cytokeratins，CKs)在正常上皮、上皮源性肿瘤及其转移性肿瘤细胞中均有表达，正常情况下如果外周血中检测出CK，提示上皮源性肿瘤细胞已转移入血，并且存活为循环肿瘤细胞。CK20、CK19是国内外公认的、最常见的上皮性组织特异性标志物。被广泛应用于乳腺癌、胃肠癌、肺癌及食管癌等上皮性恶性肿瘤淋巴结、骨髓以及外周血中微转移的检测［5～8］，显示了较好的敏感性和特异性。

李平栋等［9］研究认为CK19 mRNA可作为肿瘤标志物对喉癌和下咽癌的复发及远处转移的早期诊断提供帮助。我们前期研究已发现［10］:喉癌患者术前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA阳性表达与肿瘤的细胞分化程度无相关性，与喉癌的分型(原发部位)、T分期、临床分期及淋巴结转移的发生有相关性。本研究选取术后6、12、24月作为外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA表达的检测时间点，发现术后6、12、24月外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达均较术前显著下降(P＜0.05)，表明根据喉癌的临床分型、分期所采取的根治性治疗方案对外周血微转移具有明显的抑制作用，且该抑制作用在术后24个月内是有效的，可为临床治疗的评价提供分子生物学水平上的依据。

在术后随访的24个月内，除外1例失访，其余47例患者中共有4例出现肿瘤术后局部复发，占8.5%(4/47)，与 Jung等［7］对乳腺癌的研究结果一致。本研究中复发组术前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达高于无复发组(P＜0.05)，提示喉癌患者术前外周血微转移增加了肿瘤局部复发的机会。进一步分析复发患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达情况，结果表明，术前和术后6、12月外周血微转移差异无统计学意义(P＞0.05)，说明根治性治疗方案仍不能降低部分患者的外周血微转移的发生率，尤其是术前外周血CK19 mRNA与CK20 mRNA的阳性表达者和术后上述指标持续阳性表达者。这与Chen等［11］对肺癌的研究结果相一致。但是由于本组48例喉癌患者术后24个月内仅有4例局部复发，病例数较少，上述结论有待大样本资料的进一步研究证实。对于10例阴性对照中出现的1例CK19 mRNA阳性表达，不排除在静脉采血过程中的采血针头被上皮源性组织的污染，从而产生的假阴性表达。

［1］ Fidler IJ.7thJan Waldenstromlecture.The biology of human cancer mastatis［J］.Acta Oncol，1991，30(6)∶669-675.

［2］ Gerhard M，Juhl H，Kalthoff H.Specific detection of carcinoembryonic antigenexpressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction［J］.J Clin Oncol，1994，12(4)∶725-729.

［3］ Schoenfeld A，Luqmani Y，Smith D，et al.Detection of reast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by using polymerase chain reaction［J］.Cancer Res，1994，54(11)∶2986-2990.

［4］ Funaki NO，Tanaka J，Ohshio H.et al.Cytokeratin 20 mRNA in peripheral venous blood of colorectal carcinoma patients［J］.Br J Cancer，1998，77(8)∶1327-1332.

［5］ Jung YS，Lee KJ，Kim HJ，et al.Clinical significance of bone marrow micrometastasis detected by nested rt-PCR for keratin-19 in breast cancer patients［J］.Jpn J Clin Oncol，2003，33∶167-172.

［6］ 邬宇飞，夏加增，李 辉，等.胃肠道癌患者外周血和骨髓中微转移检测的意义［J］.中国肿瘤临床，2002，29(7)∶489-491.

［7］ Yamashita J，Matsuo A，Kumsu Y，et al.Preoperative evidence of circulating tumor cellls by means of reverse transcriptase-polymerise chain reaction for carcinoembryonic antigen messenger RNA is an independent predictor of survival in non-small cell lung cancer:a prospective study［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2002，124∶299-305.

［8］ 王景美，杜 艳，郭 英，等.食管癌患者外周血CK20、CK19、CEAmRNA的表达及其临床病理意义［J］.东南大学学报，2006，25(6)∶414-441.

［9］ 李平栋，于振坤，黄志刚，等.喉、喉咽癌患者外周血播散肿瘤细胞检测的初步研究［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2006，13(4)∶215-218.

［10］ 孟庆翔，谢景华，高雄辉，等.喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表达［J］.中国热带医学，2009，9(9)∶1708-1710.

［11］ Chen TF，Jiang GL，Fu XL，et al.Prognostic Significance of CK19 mRNA Expression Measured by Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)in Peripheral Blood of Patients with Non Small Cell Lung Cancers Treated by Chemo-radiation ［J］.1nt J RadiatOncol Biol Phvs，2004，60(Sunn1)∶237.