张校通*， 赵令卉，王小燕，王翔，申重阳，郑榆坤

（成都清科生物科技有限公司，成都，610000）

脐带血单核细胞是较为常见的一类细胞，用途较为广泛，内含丰富的造血干细胞、间充质干细胞等，且分离的脐带血单核细胞经过诱导成为在肿瘤的防治中具有重要作用的CIK（Cytokine-Induced Killer, CIK）细胞。如何保证提取脐血单核细胞的质量，减少对后期细胞培养的影响，成为单核细胞提取过程中共同关注的话题。淋巴细胞分离液的选择不仅决定着单核细胞分离的效果，而且对后期CIK诱导培养也有着重要的影响。为了在达到理想的分离提取效果以及尽可能节约实验成本，我们通过使用两种不同品牌的淋巴细胞分离液，观察使用两种不同分离液对脐带血单核细胞分离效果及对后期培养的影响，为进一步研究脐血来源CIK的生物学特性奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

主要仪器及耗材：离心机（湖南湘麓公司）；生物安全柜（珠海市再鑫仪器有限)；细胞培养箱（三洋公司）；离心管（CORNING）；移液枪（fastpette）；注射器(新叶牌）；移液管（CORNING）；T175培养瓶（CORNING）；普通显微镜（奥林巴斯公司）；血球计数板（求精公司）。

主要实验试剂：PBS（Hyclone）；ficoll淋巴细胞分离液（GE healthcare）；TBD淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物科技有限公司）；细胞培养基（Hyclone）。

1.2 方法

1.2.1 脐带血单核细胞的提取

接收到经产妇同意采集的四份脐带血后，将其编为1、2、3、4号，各份血样平均分成两份放入离心管内离心，根据液体的量加入两倍体积生理盐水混匀。然后分别以1.5∶1的比例缓慢等量加入两种淋巴细胞分离液然后离心，吸取中间的白细胞层进入离心管，根据吸入液体的量加入PBS，将细胞和PBS混匀、离心。进过两次PBS洗涤后用移液管吸取弃掉离心管上面的PBS，保留离心管底部的细胞。记录细胞的密度及活率。

1.2.2 脐带血单核细胞的诱导培养

把用两种不同淋巴细胞分离液提取的脐带血单核细胞分别装入T175的培养瓶里，然后加入25mL的诱导液，把细胞摇匀后放入37℃二氧化碳浓度5%的培养箱进行诱导培养。在细胞培养期间，根据细胞的生长密度经两种分离液提取的细胞定期加入或弃掉相同的培养液。在细胞培养的第0、4、8、12、16、20天取样进行细胞活率及密度的测定。观察两种不同培养液提取细胞对后期培养的影响。

1.2.3 细胞密度及活率的测定

（1）密度测定：将血球计数板及盖片用绸缎布擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。将7～10μL细胞悬液滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片及计数板间。静置1min后镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。

细胞数/mL = 4大格细胞总数/4×稀释倍数×10000

（2）活率测定：将细胞悬液0.5 mL加人Ep管中，加入等量的0.4%台盼兰染液，染色2～3min。取7～10μL悬液涂于载破片上并加上盖片，镜下取任意视野分别计死细胞及活细胞数，计算细胞活率。

细胞活率=活细胞数/ (死细胞数+活细胞数)

2 结果

2.1 两种分离液的提取效果及比较

脐带血分别加入两种不同分离液离心后，管中内容物分为3个清晰的层面：上层为血浆(内含血小板)，中间层为分层液，底层为红细胞和多形核白细胞[1]。在上层清晰的橙红色液体与中层清亮透明液体交界处可清楚地见到环状乳白色的层面，即为脐带血单核细胞层（如图1）。GE淋巴细胞分离液分离的细胞数量较多但明显含有较多红细胞，而国产TBD淋巴细胞分离液中红细胞较少。离心洗涤后，可以看到A管中沉淀到底层的红细胞比B管中红细胞少很多（如图2）。显微镜观察结果也表明GE淋巴细胞分离液提取出的脐带血单核细胞比TBD淋巴细胞分离液提取出的数量较多，但其中含有大量的红细胞（如图3）。

图1 两种分离液的提取效果

A管为国产TBD牌淋巴细胞分离液分离后的效果；B管为用进口GE healthcare淋巴细胞分离液分离后的效果。

图2 PBS清洗离心后效果

A管为国产TBD牌淋巴细胞分离液分离提取后经PBS清洗离心得到的效果；B管为用进口GE healthcare淋巴细胞分离液分离提取后经PBS清洗离A是用国产的TBD淋巴细胞分离液提取的结果；B是用进口的GE healthcare淋巴细胞分离液提取的结果。

2.2 单核细胞经诱导培养后CIK细胞的密度及活率

2.2.1 CIK细胞的密度

表1 两种分离液提取单核细胞的密度

由表1可以看出，用GE淋巴细胞分离液提取的单核细胞数量比用TBD淋巴细胞分离液提取的多。但实验也表明用GE淋巴细胞分离液提取的单核细胞中红细胞比较多。在后期的诱导培养中，可以看到两种方法离细胞的密度逐渐的接近。

2.2.2 CIK细胞的活率

由表2可以看出，用TBD淋巴细胞分离液提取的单核细胞与用GE淋巴细胞分离液提取的单核细胞活率接近，都可以达到90%以上，两种分离液分离细胞在后期培养中无明显差别。

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3 讨论

脐带血单核细胞是一种用途非常广泛的细胞，可以分化为多种细胞，经过诱导成为CIK细胞是一种新型的免疫细胞。与传统免疫细胞相比，CIK细胞对肿瘤具有更强大的体内外杀伤活性[2]。它主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+组成，其兼具T细胞的抗瘤活性和自然杀伤细胞非MHC限制性杀瘤作用。抗瘤性高于淋巴因子激活的杀伤细胞[3]。临床应用表明CIK细胞对肿瘤患者微小残留灶有较好疗效[4]，在结合抗原呈递细胞进行肿瘤特异性治疗[5]、基因治疗[6]等方面有更深入的临床研究价值。所以，对脐血单核细胞提取的质量要求极为严格，本试验通过比较验证了不同淋巴细胞分离液对细胞分离效果及对后期培养的影响。试验结果表明，两种淋巴细胞分离液的分离效果及后期诱导培养CIK细胞的影响，我们发现国产的TBD淋巴细胞分离液和进口的GE淋巴细胞分离液相比，前者离心后分层更清楚，提取更方便。虽然提出的单核细胞的量要比进口的GE淋巴细胞分离液提出的少一些，但后者里面所掺杂的红细胞较多，且随着后期培养二者无论在细胞密度还是活率上都已十分接近，无疑在此实验中使用TBD分离液比较经济实惠。

通过实验，为脐血单核细胞提取实验中淋巴细胞分离液的选择提供了参考，并且通过对肿瘤有杀伤作用的CIK细胞的诱导培养验证了对后期培养的影响，也为肿瘤疾病的预防和治疗提供了一定的实验基础。

[1]吴鹏，刘映峰，梁东辉，陈允钦.提高人外周血单核细胞分离率的方法探讨[J].实用医学杂志，2008，24(5)：707-708.

[2]Nagaraj S, Iske ZC, Schmidt-wolf Ki. Human cytokine-induced killers have enhanced in vitro cytolytic activity vianon-viral IL-2 gene transfer [J]. Genet Vaccine Ther, 2004, 2(1):12.

[3]Matsuda K, Tsunoda T, Tanaka H, et al. Enhancement of cytotoxic tlymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells[J]. Cancer Immunology Immunotherapy, 2004,53(7): 609-616.

[4]匡志鹏，梁安民.CIK细胞联合树突状细胞治疗恶性肿瘤的研究进展[J].现代肿瘤医学，2006，14(2)：240-242.

[5]SCHMIDT-WOLF IG, FINKE S, TROJANECK B, et al. Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma[J]. Br J Cancer,1999, 81(6): 1009-1016.

[6]MARTEN A, RENOTH S, VON LILIENFELD-TOAL M, et al.Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells[J]. Haematologica, 2001, 86(10): 1029-1037.