薛磊冰，欧贝丽，沈春燕，朱山寅，章展煌

目前市场上的减肥保健食品鱼龙混杂，一些不法商家为了追求功效，在保健食品中非法添加化学药物，最常见的添加药物是盐酸西布曲明和酚酞。目前检测这类药物的方法多为液质联用法[1－2]和高效液相色谱法[3]。笔者建立了检测盐酸西布曲明和酚酞的超高效液相色谱－串联质谱(UPLC－MS/MS)法，现报道如下。

1 仪器与试药

Acquity UPLC型超高效液相色谱仪(美国Waters公司);Quattro Premiere XE型三重四极杆串联质谱仪;10～100μL和100～1000μL单道可调移液器(德国Eppendorf公司)。盐酸西布曲明对照品(批号为100624－200401)、酚酞对照品(批号为100102－199404)，均购自中国药品生物制品检定所;瘦身美体胶囊(批号为W200903271)，粒可瘦田田雪清减润肠胶囊(批号为09030138)，天凤降脂灵胶囊(批号为20090803)，纤婷樱花精油减肥胶囊(批号为2009062301)，均为浙江省嘉兴市各县市、区食品药品监督管理局提供的市场监督抽检品;甲醇(德国Merck公司)、甲酸(美国Tedia公司)均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Acquity BEH －C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm);流动相:流动相A为0.1%甲酸甲醇溶液，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱(表 1);柱温:40 ℃ ;流速:0.2 mL/min;进样量:5 μL。

2.1.2 质谱条件

离子化方式:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子采集模式;毛细管电压:2.5 kV;二级锥孔电压(extractor):3 V;六级杆透镜电压 (RFLen):0 V;离子源温度:110℃;脱溶剂气温度(desolvation temp):300℃;脱溶剂气流量:700L/h;锥孔反吹气流量:50 L/h。采用一级全扫描模式(MSScan)时，质荷比范围为 200～450(ESI+)，锥孔电压范围为 20～35 V;选择离子二级全扫描模式(daughter scan)、二级离子监测扫描模式(MRM)时，化合物的准分子离子峰、主要子离子碎片峰及其采集参数见表2。

表1 流动相梯度洗脱表

表2 盐酸西布曲明和酚酞的二级质谱参数

2.2 溶液制备

精密称取盐酸西布曲明对照品50.0 mg和酚酞对照品50.0 mg，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液;精密量取该溶液适量，用流动相逐步稀释制成质量浓度为200 ng/mL的混合对照品溶液。取样品10粒，精密称定，将内容物置碾钵中研磨混匀，称取1粒样品的量，置100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解15 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀后过滤，取续滤液适量，用流动相逐步稀释，作为供试品溶液。

2.3 定性鉴别

分别取混合对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液质联用仪，在相同的色谱及质谱条件下，对供试品溶液和对照品溶液进行一级全扫描质谱分析(MSScan)，均检测到盐酸西布曲明和酚酞的准分子离子峰 m/z 280和 m/z 319(图1);分别对 m/z 280和m/z319进行二级全扫描质谱分析，均产生完全一致的碎片离子(图2);选择丰度较强、性质较稳定的两个子离子作为提取离子进行MRM分析，获得相应的MRM色谱图，供试品与对照品溶液的MRM色谱峰保留时间一致(图3)。结合一级全扫描质谱准分子离子、二级质谱裂解碎片、多反应检测模式色谱峰保留时间三方面的信息，可证实这4批减肥类保健食品中均添加了盐酸西布曲明和酚酞。

图1 一级全扫描离子流图和质谱图

图2 二级全扫描质谱图

图3 MRM色谱图

2.4 定量测定

2.4.1 方法学考察

线性关系考察:精密量取2.2项下盐酸西布曲明对照品贮备液500μL和酚酞对照品贮备液200μL，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，制成盐酸西布曲明和酚酞质量浓度分别为2μg/mL和5μg/mL的混合对照品溶液。取该溶液，逐步用流动相稀释至盐酸西布曲明质量浓度为 400，200，100，40，20 ng/mL，酚酞质量浓度为 1 000，500，250，100，50 ng/mL 的混合对照品溶液，分别吸取5μL，注入液质联用仪，选择性质稳定的两个子离子作为提取离子，表1中用“_”标注的碎片离子作为定量离子，另一个作为辅助定性离子，测定盐酸西布曲明和酚酞定量离子的峰面积(X)，计算得质量浓度的回归方程分别为 Y=0.003 463 X－94.10(r=0.999 0)和 Y=0.007 534 X －115.68(r=0.999 5)。结果表明，盐酸西布曲明质量浓度在20～2 000 ng/mL、酚酞质量浓度在50～5 000 ng/mL范围内与峰面积线性关系良好。

加样回收试验:取已知含量的样品细粉，精密称取0.5粒的量，置50 mL容量瓶中，精密加入盐酸西布曲明对照品贮备液12，15，18 mL，酚酞对照品贮备液5，6，7 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，照2.1项下条件进行测定，计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果(n=3)

定量限试验:取对照品溶液，稀释成不同质量浓度的溶液后，采用MRM方式进行测定。结果盐酸西布曲明和酚酞的最低定量限(S/N=10)分别为 0.05，0.4 ng/mL。

精密度试验:取2.2项下混合对照品溶液5μL，连续进样6次，以280＞125通道的MRM色谱峰峰面积计算。结果峰面积的RSD为1.6%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，每隔一定时间分别测定其盐酸西布曲明和酚酞的含量。结果的 RSD为1.2%(n=5)，表明供试品溶液在32 h内稳定。

2.4.2 样品含量测定

取2.2项下供试品溶液5μL，分别注入液质联用仪，按2.1项下所述方法和参数进行MRM分析，测定盐酸西布曲明和酚酞定量离子的MRM色谱峰峰面积，代入回归方程计算含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果

3 讨论

盐酸西布曲明是一种新型中枢性作用的肥胖症治疗药，对控制体重有较好的疗效，但长期服用可引起失眠、头痛、头晕等不良反应[4]。酚酞则有促进肠蠕动而起到缓泻的作用，长期服用会诱发顽固性便秘、肠炎皮疹、大出血等。笔者曾对市场上的减肥类保健品进行抽检，发现多批样品中均添加了盐酸西布曲明和酚酞。因此，对此类化学药物建立准确、灵敏、可靠的检测方法很有必要。

本研究采用Acquity BEH C18色谱柱进行分析，与传统的高效液相色谱法比较，分析时间大大缩短，同时具有更高的灵敏度和更好的分离度;以多反应监测(MRM)模式采集定量离子，以其峰面积代入回归方程，可以准确计算出样品中被添加的盐酸西布曲明和酚酞的含量。MRM模式具有灵敏度高、干扰小等优点，可使色谱行为相似的物质，根据分子量和碎片质量的不同而得到完全分离，并可显著去除基质干扰。

过高浓度的样品不仅易对质谱造成污染，同时也会产生离子抑制现象，从而影响样品测定的准确率，因此不宜选择过宽的线性范围。同样，在测定实际样品时，由于违法添加化学药物的保健品不会标示添加物的含量，因此样品的配制应尽量避免过高浓度。测定时，以浓度较低的供试品溶液初步探索样品中添加物的含量，再根据需要测定浓度较高的样品，以确保结果的准确性。

[1]车宝泉.液质联用检查中药制剂及保健食品中减肥类药物[J].药物分析杂志，2009，29(4):633.

[2]曾祥林.HPLC－MS/MS检测中药制剂及保健食品中添加6种减肥药物的研究[J].中国药学杂志，2009，44(17):1 339.

[3]胡 青，季 申.减肥类保健食品中非法添加酚酞定性定量检测方法的研究[J].中国药学杂志，2007，42(8):624.

[4]曾 涛.常用减肥药物的不良反应[J].中国药师，2007，10(6):599.