心脑通络液预处理联合针刺后处理对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响

2011-06-04李书霖林诚祥李延田伟

中医药信息 2011年4期

关键词：心脑后处理通络

李书霖，林诚祥，李延，田伟

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001;2.香港施隆寶药业行，香港;3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040;4.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

目前认为，细胞凋亡是缺血再灌注损伤发生机制中的一个重要环节［1］。本研究拟观察心脑通络液预处理联合针刺后处理对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响。

1 材料

1.1 实验动物健康雄性Wistar大鼠36只，体质量(250±30)g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心。

1.2 实验试剂 TUNEL凋亡检测试剂盒;戊巴比妥钠;肝素钠注射液;磷酸缓冲液;10%缓冲中性甲醛溶液。

1.3 主要仪器 J0－020型小动物呼吸机;Mplso16型导电生理记录仪;GL－16G台式高速离心机;电子分析天平;全自动生化分析仪等。

2 方法

2.1 缺血再灌注模型的制备［2］

采用穿线结扎法结扎大鼠左冠状动脉前降支30min，造成心肌缺血，松开结扎导致再灌注120min建立缺血再灌注损伤模型。常规心电图监测心肌缺血变化，以结扎后ST段下降1/3以上者以及ST段抬高(或心电图QRS波突然增高、增宽或T波高耸)为合格模型。

2.2 实验动物分组

正常组:大鼠正常饲养，不作任何手术处理。

假手术组:大鼠预先灌服生理盐水10ml/kg 7天，开胸后在冠状动脉左前降支(LAD)下穿线，不结扎。

缺血再灌注组:大鼠预先灌服生理盐水10ml/kg 7天，结扎LAD造成缺血30min，再灌注120min。

心脑通络液预处理组:大鼠预先灌服心脑通络液10ml/kg 7天，然后结扎LAD造成缺血30min，再灌注120min。

针刺后处理组:结扎LAD造成缺血30min，再灌注120min，再灌注的同时采用全能脉冲电疗仪，对大鼠内关穴进行电针针刺30min，频率为1Hz，电压为2V，强度以肢体轻微抖动为度。

心脑通络液预处理组+针刺后处理组:大鼠预先灌服心脑通络液10ml/kg 7天，然后结扎LAD造成缺血30min，再灌注120min。再灌注的同时采用全能脉冲电疗仪，对大鼠内关穴进行电针针刺30min，频率为1Hz，电压为2V，强度以肢体轻微抖动为度。

2.3 实验结果测定取结扎线以下损伤心肌组织，冲洗并吸干水分，立即置于10%中性甲醛溶液固定，然后常规脱水、石蜡包埋、切片(所用玻片预先经多聚赖氨酸处理)、常规脱蜡水化。将切片置入稀释的含1%蛋白激酶K溶液中消化8min，PBS洗涤2min×3次。双蒸水洗2min×3次。加标记缓冲液，以保持切片湿润。取lml封闭液加SABC 10ul，混匀后加至切片上。37℃，2h。PBS洗片，5min×4次。再用DAB显色10～20min，双蒸水洗2min×3次。再用苏木素复染，PBS及双蒸水洗2min×3次。脱水、透明、封片。以PBS代替 TdT反应液，余操作相同，为阴性对照。经TUNEL法染色的切片在光学显微镜下，显微摄像，经图象分析系统检测分析。检测心肌细胞凋亡阳性细胞的个数和阴性细胞的个数，以心肌凋亡阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比作为心肌细胞凋亡指数。

3 结果

经TUNEL法染色后，光镜观察:以细胞核着棕黄色颗粒为阳性，无棕黄色颗粒者为阴性。正常组、假手术组仅可见少量棕黄色颗粒;缺血再灌注组心肌细胞凋亡个数较其他组为多，心脑通络液预处理组、针刺后处理组、心脑通络液预处理+针刺后处理组与缺血再灌注组比较凋亡细胞个数明显减少，AI明显减小，具有显著性差异(P＜0.01)，其中心脑通络液预处理+针刺后处理组与心脑通络液预处理组、针刺后处理组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。各组心肌细胞凋亡指数的变化见表1、图1。

表1 各组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较(±s)

注:与I/R组比较，★P＜0.01;与心脑通络液预处理组、针刺后处理组比较，▲P＜0.05。

Normal组6 3.3 ±0.6 Sham 组 6 3.9 ±0.5 I/R 组 6 25.9 ±5.4心脑通络液预处理组 6 14.4 ±3.9★针刺后处理组 6 13.6 ±3.4★心脑通络液预处理+针刺后处理组 6 10.8±3.6★▲

4 讨论

心细胞凋亡是缺血再灌注损伤的特征性改变，细胞凋亡的发现对缺血再灌注损伤的预后判断具有重要意义。从而提示我们可以从细胞凋亡角度对缺血/再灌注后心功能的恢复及心肌保护进行研究。大量证据已表明，在心肌缺血/再灌注损伤中，凋亡是细胞数量减少的原因之一［3］。本研究结果亦证实:缺血再灌注组大鼠心肌组织受损程度严重，TUNEL法检测所见凋亡细胞明显增多，心脑通络液预处理组、针刺后处理组、心脑通络液预处理+针刺后处理组与缺血再灌注组比较凋亡细胞个数明显减少。从而进一步证实:心肌缺血再灌注损伤可导致细胞凋亡;心脑通络液预处理、针刺后处理可明显抑制缺血再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡，降低缺血再灌注损伤的程度，对心肌有良好的保护作用。