李洪涛，高曦，王树人，王波

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

糖皮质激素在世界范围内得到了广泛的应用，激素性股骨头坏死是其严重的并发症，也是临床常见病、多发病，病人绝大多数为青壮年，且病情顽固。该病的发病机理目前还不是十分清楚，因此对该病的病理机制和发病过程的研究意义重大。在早期应用糖皮质激素的同时，针对其中的关键环节早期干预能减少激素性股骨头坏死的发生。糖皮质激素主要和糖皮质激素受体α(GR－α)结合，发挥其生理及药理功能，糖皮质激素受体α的密度及亲和力与糖皮质激素的作用成正相关。所以在激素性股骨头坏死早期检测在股骨头局部GR－α mRNA的变化，探讨其发病机制，有助于我们寻找早期进行防治的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用纯种健康54只雄性成年日本大耳白兔，体质量(3.0±0.2)kg(黑龙江中医药大学动物实验中心提供，所有动物单笼喂养，通风，自由饮水进食，普通草料喂养)。

1.2 主要仪器及药品试剂

马血清(HyClone公司);甲强龙(注射用甲泼尼龙琥珀酸钠，Pfizer生产);骨蚀灵胶囊(黑龙江中医药大学附属第一医院制药厂);引物(上海超世生物科技有限公司合成);TRIzol Reagent(Invitrogen公司);DEPC(Sigma公司);RT－PCR试剂盒(Promega公司);宝生物rTaq酶及配套试剂;ABI 9700型PCR扩增仪;台式低温高速离心机(Heraeus instruments，德国);稳压稳流定时电泳仪(BIO－RAD，美国);水平电泳槽(BIO－RAD，美国);紫外分光光度计(BIO－RAD，美国)。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组

54只日本大耳白兔适应性喂养2周后，精确称重，以随机数字表法将兔子随机分为3组。Ⅰ组:空白对照组，12只。Ⅱ组:模型组，Ⅲ组:治疗组。Ⅱ、Ⅲ两组共42只，两次马血清注射过程中死亡6只，两次血清注射后再将注射马血清的家兔随机分配至Ⅱ、Ⅲ组中，每组18只，三组动物体重经t检验差异无统计学意义(P＞0.05)。

Ⅰ组:空白对照组(简称空白组)12只;Ⅱ组:糖皮质激素组(简称模型组)18只;Ⅲ组:骨蚀灵组(简称治疗组)18只。

1.3.2 动物模型的建立及处理措施

模型组和治疗组每只第1次经耳缘静脉注射马血清10mL/kg，间隔3周。第2次按6mL/kg剂量再注射马血清1次，间隔2周，然后分别按45mg/kg连续3天，腹腔注射甲强龙3次，注射激素期间各组家兔均臀肌注射青霉素8万u/只抗感染。空白组与模型组和治疗组于相同时间点于耳缘静脉和臀肌注射等量生理盐水作为对照，激素注射4周、8周后分别处死全部动物。

根据标准体重动物的公斤体重剂量换算公式［1］，换算人－兔的生药量。于激素注射结束后第2天开始，按人与兔体表面积换算出的用药量开始灌胃给药。空白组和模型组应用蒸馏水进行空腹灌胃，20mL/2d。治疗组给予骨蚀灵胶囊粉末8.16g/kg，相当于生药2.04g/kg，用蒸馏水调成混悬液20mL，空腹灌胃给药，1次/2日。

2 数据收集及统计

采用SPSS 11.5对数据进行统计，所有资料均用均数±标准差(Mean±SD)表示，各组数据组间比较使用one－way ANOVA方法统计，两组均数之间的比较应用t检验，多个均数之间的比较应用S－N－K检验。计数资料应用 χ2检验(Chi－square test)，P＜0.05表示差异有显著性。

3 结果

3.1 引物

3.2 β－actin表达

3.2.1 4周β－actin表达 结果见图1。

图1 4周β－actin表达

3.2.2 8周β－actin表达 结果见图2。

图2 8周β－actin表达

3.3 GR－α mRNA的表达

3.3.1 4周GR－α mRNA的表达 结果见图3，表1。

图3 4周GR－α mRNA表达

3.3.2 8周GR－α mRNA的表达 结果见图4，表1。

图4 8周GR－α mRNA表达

表1 4周、8周GR－α mRNA样本表达量(±s)

表1 4周、8周GR－α mRNA样本表达量(±s)

注:与空白组比较，★P＜0.05;与治疗组比较，▲P＜0.05。

4 周 0.2061 ±0.0136 0.3626 ±0.0254★ 0.4236 ±0.0212★▲8 周 0.1615 ±0.0737 0.4051 ±0.0259★ 0.4514 ±0.0262★▲

4 讨论

糖皮质激素具有多种强大的作用，其作用通过糖皮质激素受体介导。作为配体依赖性的转录调节因子，GR与糖皮质激素结合后，能转入核内调节基因表达，产生各种效应。应用激素后可以造成血液的高凝状态，导致在股骨头局部的低氧环境。所以GR在激素性股骨头坏死的病程中具有重要作用，而GR－α又是主要的作用受体，因而通过研究在股骨头局部特定低氧环境下糖皮质激素和GR－α的相互关系的变化至关重要。在微观局部环境下，低氧和糖皮质激素受体关系密切，低氧可以造成糖皮质激素受体的上调，并产生一种糖皮质激素依赖的倾向。将糖皮质激素受体减少后，在低氧中糖皮质激素的作用被减弱。将低氧诱导因子－1α过表达，可造成糖皮质激素受体的上调，并增强糖皮质激素依赖的活性。由此可见，低氧环境可引起糖皮质激素受体的上调，从而增加糖皮质激素的敏感性，这不仅是一种糖皮质激素依赖反应的调节，还是一种低氧依赖反应和基因表达的调节。在本实验中应用半定量RT－PCR法检测不同时间点GR－α mRNA表达，GR－α mRNA的表达随着时间推移各组表达量逐渐升高，进一步增强了糖皮质激素对股骨头局部的作用。近年来，中医药在调节GR的研究上取得了可喜的成绩，中药和糖皮质激素合用能够发挥糖皮质激素的重要作用，同时能降低GC的不良反应［1］，发挥中医“治未病”的优势，具有重要的研究价值。

［1］康天济，蒋爱丽.补肾实骨汤治疗糖皮质激素性骨质疏松的实验研究［J］.中医药学报，2009，37(4):32－35.