邓 翀，颜永刚，姚天鹅

(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)

白鲜皮为芸香科植物白鲜 (Dictamnus dascarpus Turczl)的干燥根皮，是一种常见的中草药，为历代本草及中国药典收藏。别名有白鲜，藓皮，地羊膻，金雀儿椒，八股牛，白羊鲜等。其味咸，苦，性寒，具清热燥湿，祛风解毒，止痒等功效。临床用于湿热疮毒，黄水淋漓，湿疹，风疹，疥癣疮癞，风湿热痹，黄疸尿赤等症[1]。目前对白鲜皮提取工艺的研究报道主要以总浸膏量和白鲜碱为评价指标进行研究[2－3]。由于总浸膏量为评价指标缺乏准确性以及白鲜碱为评价指标的单一性，本实验从整体化学成分角度，以HPLC化学指纹图谱的多成分相对含量为控制指标考察白鲜皮的提取工艺，筛选白鲜皮提取工艺。为白鲜皮提取分离提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效色谱仪 (L－2130二元泵，L－2400检测器，日本日立公司)，电子天平 (萨多利斯GB2042电子天平 (瑞典)，0.1mg)，电热恒温水浴锅 (北京市光明医疗仪器厂)。

1.2 材料

白鲜皮采集于陕西省太白山红河谷 (由陕西中医学院王继涛高级实验师采集并鉴定);白鲜碱对照品 (购自中国药品生物制品检定所，批号:111654－200301);色谱乙 (科密欧公司);水为娃哈哈纯净水;其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液制备

精密称取白鲜皮药材粉末 (60目筛)约5g，以适当的溶剂为提取溶媒，按照实验设计的方法进行提取，滤过，提取液在80℃水浴浓缩，挥干溶媒，以95%乙醇溶解，定容于100mL量瓶中。储存于4℃，冷藏待用。

2.1.2 对照品溶液配制

精密称取白鲜碱对照品10.81mg，以甲醇溶解，定容在25mL的量瓶中作为对照品母液，浓度为0.4324mg/mL;精密吸取对照品母液2.0mL，以甲醇定容在10mL量瓶中，作为对照品溶液，浓度为0.08648mg/mL。

2.2 指纹图谱测定方法建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱:大连依利特C18色谱柱;流动相A相为乙腈，B相为0.4%磷酸水溶液;梯度洗脱程序:0～10min，A相5%～20%;10～15min，A相20%～30%;15～25min，A相30%～30%;25～40min，A相30%～45%;40～60min，A相45%～65%;60～70min，A相65%～100%;70～75min，A相100%～100%[4]。检测波长:228nm;流速:1mL/min;温度:室温;进样量:10μL。对照品白鲜碱色谱图见图1，指纹图谱色谱图见图2。

2.2.2 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样5次，28个共有色谱峰相对保留时间RSD小于3%，28个共有峰面积RSD不超过5%，表明进样的精密度良好。

2.2.3 重现性试验

取同一供试品5份，分别按供试品溶液的制备方法制备供试品并测定，28个共有色谱峰相对保留时间RSD小于3%，28个共有峰面积RSD不超过5%，表明其重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12h检测，28个共有色谱峰相对保留时间RSD小于3%，28个共有峰面积RSD不超过5%，说明供试品溶液至少在12h内稳定。

2.3 提取溶剂选择

取白鲜皮药材粗粉末 (过4号筛)5g，分别用8倍量甲醇、乙醇和0.2%盐酸水溶液为提取溶媒，超声30min，按“2.2.1项”下色谱条件测定，根据“2.8项”下计算方法计算，选择提取溶剂。

2.4 提取方式选择

取白鲜皮药材粗粉末 (过4号筛)，等量精密称取2份，8倍量的以95%乙醇为溶剂，分别用超声法、回流法提取，制备成等体积的溶液。按“2.2.1项”下色谱条件测定，根据“2.8项”下计算方法计算，选择提取方式。

2.5 正交试验法研究白鲜皮提取工艺

对影响醇提取工艺的主要因素溶媒浓度 (因素A)、溶剂用量 (因素B)、提取次数 (因素C)和提取时间 (因素D)进行L9(34)实验，因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.6 样品测定

取正交实验法项下的9个供试品溶液吸取20μL，以指纹图谱测定条件进样分析，记录色谱图。

2.7 评价方法

用多指标实验公式法进行数据处理[5]。以Xij表示第i次实验中第j个指标的测定值 (即Xij表示正交实验的第i次实验的色谱图中第j个色谱峰峰面积值，其中在正交实验各次实验的色谱图中所选定的色谱峰是根据活性部位指纹图谱而确定的，它们相对应的色谱峰的相对保留时间是一致的)，i=1，2，…，n;j=1，2，…，k。首先以各指标的最大值 (即各色谱图中同一相对保留时间的各色谱峰中峰面积值最大者)作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i个测定值的标准化数据。

再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定加权系数。以SDj表示第j个指标下Dij的标准差，以RSDj表示第j个指标的相对标准差，则根据各指标相对标准差赋权为RSD/RSDj，其中RSD为指定指标 (参照物白鲜碱)的相对标准差;根据各指标的重要程度赋权为Ej，由于不能确定各组分对药效的贡献大小，故认为指纹图谱中的各个色谱峰 (群)所代表的各组分 (群)都很重要，均设为1。结合各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定的权重系数为:

因此，多指标实验公式为:

[3]式计算所得的兼顾各指标综合效应的公式，得分越大越好。

3 结果

表2 正交实验安排及结果表

3.1 提取溶媒选择结果

根据实验数据分析，甲醇、乙醇和0.2%盐酸水溶液3种提取溶媒的综合评分分别为56.43372，70.30897，55.69554。故本实验选择不同乙醇为提取溶媒。

3.2 提取方式选择结果

根据对超声和回流提取方式实验数据比较，超声和回流两种提取方式综合评分分别为66.73388，71.04552，故本实验选择回流为提取方式。

3.3 正交试验结果

在前述提取条件初筛的基础上，采用4因素3水平正交实验法对溶媒浓度、提取溶剂倍量、回流时间、回流次数进行优化研究，试验设计见表1。将各白鲜皮提取液分别定容至25mL量瓶中，0.45μm滤膜滤过后，用“2.2.1项”色谱法测定各溶液中28个共有峰面积为指标，对数据进行标准化处理，结果及极差分析见表2，方差分析见表3。

表3 公式评分方差分析表

以多指标实验公式法统计分析P值为考察指标，由表2中极差R值大小显示，各因素作用主次为A＞D＞C＞B;由表3中方差分析结果表明[6]:因素A具有显著性差异，以A2B3C1D2组合为佳，即最佳工艺条件为料液比12倍，乙醇浓度75%，提取次数1次，提取时间1.5h。

3.4 验证试验

根据正交实验结果对A2B3C1D2工艺条件重复3次实验，以验证该工艺的合理性和稳定性，结果无显著性差异，RSD值为2.433。最后确定的最佳提取工艺为料液比12倍，乙醇浓度75%，提取次数1次，提取时间1.5h。

4 讨论

中药药效是多成分、多靶点整体作用的结果，在对中药的提取工艺优选过程中，若只采用某单体成分含量为优化指标，不能反映全方的整体效应。在以往对中药的提取工艺研究中，往往只局限于以干浸膏得率、单体含量和化学部位含量为指标进行工艺的优选，具有一定的局限性。本文对白鲜皮醇提工艺优化的过程中，尝试采用未知结构成分的模糊数据 (特征色谱峰面积之和)相结合的形式，进行多指标综合评定优化提取工艺，较之于以往可以更全面地反映提取物的成分信息。

尽管指纹图谱可以提供较为丰富的中药提取物信息，但是本实验中采用紫外检测器，只能提供药液中具有紫外吸收的成分的相对含量信息;且指纹峰所对应成分的药效作用尚不完全清楚，在中药提取工艺的优化方面尚不能实现所有药效组分的提取与检测。在未来工作中，有待于结合现代高通量筛选技术，追踪各成分的药物活性;同时，可以尝试建立药液的液质联用指纹图谱，借助质谱等更加灵敏、通用的检测系统，进行全成分的高效分析、检测，提高中药制剂的提取效率和制剂水平，推进中药研究的现代化进程。

[1]中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典(2010年版)一部 [M]．北京:化学工业出版社，2010:92．

[2]苏伟梁，靳丽梅．正交法优选白鲜皮的提取工艺[J]．黑龙江医药，2006，19(1):16－17．

[3]梁红，韦宝韩，黄光伟，等．正交试验法研究白鲜皮的提取工艺 [J]．广西轻业，2009，12(5):16－17．

[4]杜程芳，屠鹏飞．白鲜皮药材指纹图谱研究 [J]．中国天然药物，2003，1(2):94－98．

[5]韩可勤，杨静化，刘晓东．药学应用概率统计[M]．南京:东南大学出版社，2000:1301．

[6]腾海英，祝国强，黄平，等．正交试验设计实例分析[J]．药学服务与研究，2008，8(1):75－76．