朱宝英，赵立波，王茜，张春燕，陈欣，黄静，方翼#b（1.贵阳医学院，贵阳市 550004；.北京大学人民医院，北京市 100044）

氯法拉滨是第2代嘌呤核苷酸类似物[1]，可用于治疗儿童难治性或复发性急性淋巴细胞白血病（ALL）[2，3]。其作为一种新型的抗癌药，既能抑制脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶，使DNA合成终止，又能抑制核苷酸还原酶，从而终止DNA链的延长及修复。该药于2005年1月在美国上市，对急性白血病尤其有效，作为近10年来首个获准专门用于治疗儿童白血病的新药，主要用于治疗儿童难治性或复发性ALL，是目前唯一专门用于儿童急性白血病的化疗药[4]，国内尚无相关制剂上市。目前有关氯法拉滨血药浓度的测定方法，国外报道不多[5～7]，国内也仅见1篇报道[8]。本研究旨在应用近年来迅速发展的高效液相色谱串联质谱电喷雾（HPLC-MS/MS）检测技术，建立一种简便、灵敏、快速、准确的人血浆中氯法拉滨浓度的定量分析方法，以满足氯法拉滨药动学研究的需要。

1 材料

1.1 仪器

1200型高效液相色谱包仪，包括G1312A型二元输液泵、G1329A型自动进样器、G1316A型柱温箱、G1379B型脱气机（美国Agilent公司）；AB SCIEX QTRAP5500型三重四极杆线性离子阱串联质谱仪，配备电喷雾电离源（Turbo Ionspray）、Analyst1.5.1分析软件（美国Applied Biosystems公司）；Vortex-2 GENIE涡旋混合器（美国Scientific Industrics公司）；MD 200 Sample concentiator型氮吹仪（北京晨曦科创科技发展公司）；Anketdl-40B型普通离心机（上海安亭科学仪器厂）；Ministart plus型微型高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；KH-600E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；GM-50（天津腾达过滤器件厂）；CPA225D型万分之一天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

氯法拉滨对照品（批号：20100709）、克拉屈滨对照品（内标，批号：AP-010-B101202）、喷司他汀对照品（稳定剂）均为浙江贝达药业有限公司提供；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚、甲酸、乙酸铵为色谱纯，水为Direct-Q®超纯水系统（美国Millipore公司）自制。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Thermo C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（250∶3，其中含4 mmol·L－1的乙酸铵和0.3% 的甲酸）；流速：0.5 mL·min－1；进样量：10 μL；每个样品的分析时间：5 min。

电喷雾离子源：正离子扫描；喷雾口位置：3∶5；Gas 1：35.0 Psi；Gas 2：70.0 Psi；气帘气压力：35.0 Psi；碰撞气压力：Medium；离子源电压：4500.0 V；离子源温度：600℃；多离子反应监测（MRM）扫描分析，用于定量氯法拉滨和克拉屈滨的离子反应分别为m/z 304.2→170.0，m/z 286.1→170.0。

在该色谱及质谱条件下，考察6个来自不同个体的质谱图，空白血浆、对照品加入到空白血浆中和受试者服药后的血浆样品色谱图见图1。

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 氯法拉滨工作溶液：准确称取氯法拉滨对照品适量，加入少量甲醇溶解并定容，配成浓度为1 mg·mL－1的贮备液1，并从中取出少量稀释并定容，配成浓度为100 μg·mL－1的贮备液2。将贮备液2用流动相稀释成系列工作溶液供分析用。

图1 液-质图谱A.质谱图；B.空白血浆；C.对照品+空白血浆；D.受试者服药后的血浆样品Fig 1 HPLC-MS/MSA.MS；B.blank plasma；C.standard control+blank plasma；D.blood sample of patients

2.2.2 内标溶液：准确称取内标克拉屈滨对照品适量，用甲醇溶解并定容，配成浓度为1 mg·mL－1的贮备液3，并从中取出少量用甲醇稀释并定容，配成浓度为100 μg·mL－1的贮备液4。从贮备液4中取适量，用流动相稀释成浓度为1 μg·mL－1的内标溶液。

将以上所有溶液置于4℃冰箱保存待用。

2.3 样品预处理

精密量取含喷司他汀10 μmol·L－1的空白血浆200 μL，置于7.0 mL塑料离心管中，加入内标溶液（1 μg·mL－1克拉屈滨）涡旋混匀1 min，然后加入提取剂甲基叔丁基醚3.0 mL，涡旋混匀10 min，4000 r·min－1离心5 min 后，取上清液2.6 mL，40 ℃氮气吹干，加入流动相200 μL 复溶，涡旋混匀3 min，13400 r·min－1离心5 min 后，取上清液10 μL 进样分析。

2.4 标准曲线的制备

取含喷司他汀10 μmol·L－1的空白血浆200 μL，分别加入不同浓度的氯法拉滨工作溶液20 μL，使血浆中氯法拉滨浓度分别为2.5、5、10、20、50、100、200、500 ng·mL－1，所有样品按“2.3”项下方法操作，记录色谱。以氯法拉滨与内标峰面积比（Y）对氯法拉滨浓度（X）进行线性回归，得到回归方程Y＝0.0138X－0.000545（r＝0.9999），权重因子W＝1/X2。结果表明，氯法拉滨血药浓度在2.5～500 ng·mL－1范围内线性关系良好，最低定量限为2.5 ng·mL－1。

2.5 精密度及方法回收率试验

分别配制浓度为5、50、200 ng·mL－1的血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理样品，进样分析，考察氯法拉滨日内精密度及方法回收率；连续测定3 d，考察日间精密度。方法回收率及精密度试验结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果（±s ，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

表1 回收率及精密度试验结果（±s ，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

加入量/ng·mL-1 550200日间RSD/%4.0913.9411.07测得量/ng·mL-1 4.77±0.2649.09±3.29197.00±13.19方法回收率/%95.6498.8399.23日内RSD/%4.774.475.64

2.6 基质效应及提取回收率的考察

取含喷司他汀的空白血浆200 μL于离心管内，按“2.4”项下方法处理，氮气吹干后，分别用浓度为 5、50、200 ng·mL－1的氯法拉滨标准溶液200 μL复溶，每个浓度配置5份样品，取10 μL进样分析，以得到色谱峰面积A与同样浓度的氯法拉滨标准溶液直接进样获得的色谱峰面积B的比值，考察基质效应。另分别配制浓度为5、50、200 ng·mL－1的血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理样品，进样分析得到血浆样品中氯法拉滨的峰面积C，C/A×100%即为提取回收率。结果表明，氯法拉滨低、中、高3种浓度的基质影响的RSD分别为9.93%、5.76%、11.38%。可见，该方法基质效应小，具有特异、专一地测定分析物质的能力。氯法拉滨低、中、高3种浓度提取回收率分别为81.79%、66.03%、77.40%，相应的RSD分别为12.02%、5.75%、4.80%。

2.7 样品稳定性考察

配制浓度为5、50、200 ng·mL－1的血浆样品各3份，分别将处理前、后的2批样品置于室温下放置24 h，将另一批样品反复冻融3次后，均按“2.3”项下方法处理，进样分析，当日随行双标准曲线，考察样品稳定性。样品稳定性结果见表2。

表2 样品稳定性考察结果（n＝3）Tab 2 Results of stability tests of samples（n＝3）

2.8 方法应用

测定了3位静脉滴注氯法拉滨（52 mg·m－2·d－1）2 h的白血病患者（已签署知情同意书）给药前及给药后不同时间点的血药浓度。1名白血病患者注射氯法拉滨后的药-时曲线见图2。

图2 1名白血病患者注射氯法拉滨后的药-时曲线Fig 2 Plasma concentration-time curve of clofarabine in a leukemia patient after the injection of clofarabine

3 讨论

据外文文献报道[6]，样品处理的方法采用乙腈沉淀蛋白法，考虑到沉淀法处理的样品杂质较多，故本试验采用液液提取法处理样品。另外文献报道[8]采用乙酸乙酯提取法处理血浆，本试验则比较了乙酸乙酯、乙醚和甲基叔丁基醚3种溶剂分别作为提取剂的提取效果，结果甲基叔丁基醚整体效果较好，故选用甲基叔丁基醚提取法处理血浆。因此，本试验参考文献[8]所定线性范围为2.5～500 ng·mL－1，使检测结果更灵敏、准确。

[1]赵 君，陈祥峰.毛细管气相色谱法检测氯法拉滨中的残留溶剂[J].药学与临床研究，2008，16（4）：330.

[2]聂颖兰，傅得兴，胡 欣，等.新型抗白血病药氯法拉滨[J].中国新药杂志，2007，16（10）：821.

[3]孟德胜，傅若秋，张 蓉，等.HPLC法测定氯法拉滨原料药中有关物质的含量[J].中国药房，2009，20（31）：2461.

[4]孟德胜，傅若秋，张 蓉，等.GC法检测氯法拉滨中有机溶剂的残留量[J].中国药房，2009，20（28）：2200.

[5]Judith E，Rebecca M，Kumudha B，et al.A phaseⅠclinical-laboratory study of clofarabine followed by cyclophosphamide for adults with refractory acute leukemias[J].Clinical Trials and Observations，2007，110（6）：1762.

[6]Hsieh Y，Christine J，Lee S，et al.Comparision of fast liquid chromatography/tandem mass spectrometric methods for simultaneous determination of cladribine and clofarabine in mouse plasma[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，44（5）：492.

[7]Gandhi V，Kantarjian H，Faderl S，et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of plasma clofarabine and cellular clofarabine triphosphate in patients with acute leukemias[J].Clin Cancer Res，2003，9（17）：6335.

[8]张春燕，朱宝英，赵立波，等.高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中氯法拉滨的浓度[J].中国药学杂志，2010，45（19）：1496.