王天琳，吴春福

尿嘧啶是RNA特有的碱基，是中枢神经系统中最重要的神经递质之一，除参与核苷酸的从头合成通路外，还可作为嘧啶核苷酸补救合成通路的基质，也是磷酸卵磷脂(PC)和脑磷脂(PE)合成通路中的重要物质［1-2］。近年来，其功能的多元化越发引起人们的注意，尿嘧啶含量的检测也逐渐成为人们关注的焦点［3］，但检测动物脑脊液中尿嘧啶的方法鲜有报道。因此，本文利用在体微透析技术结合高效液相色谱(HPLC)，建立了检测脑脊液中尿嘧啶含量的方法，为中枢系统研究中尿嘧啶含量的检测提供一种有效、可靠、重复性好的方法。

1 材料

1.1 仪器 岛津LC10AT型恒流泵，SPD10AVP紫外检测器，L2000色谱工作站;VertiSep GES-C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，马来西亚);小鼠脑立体定位仪(第二军医大学江湾-1型C);307-2B型牙科台式电钻车(宁波医疗器械厂);ZSB-1A自动注射泵(航空航天部北京星达技术开发公司);透析管(分子量50 000 EICOM，日本)。

1.2 试剂与药品 Uracil标准品(Sigma，美国)，Uridine标准品(Sigma，美国);乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)，磷酸二氢钠(分析纯，沈阳市试剂三厂)，磷酸(分析纯，沈阳化学试剂厂)，Ringer's液(自制)，冰块(自制)。所有溶液均用去离子水配制。

1.3 实验动物 雄性昆明种小鼠［动物合格证号:SCXK(辽)2008-2010］，体质量18 ～22 g，购于沈阳药科大学实验动物中心，动物饲养在室温环境下，自由摄食饮水。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱:VertiSep GES C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相:乙腈 － 0.02 mol/L磷酸二氢钠(2∶98)，磷酸调pH值为3～4;检测波长:260 nm;流速:0.8 mL/min;柱温:0～5℃;进样量20 μL;理论塔板数不低于2 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准品溶液的配制 精密称取Uracil和Uridine 溶于 Ringer's(147 mM NaCl，2.2 mM CaCl2，4 mM KCl)液［4］中，制得 Uracil和 Uridine浓度均为1.0 μg/mL的标准溶液，涡旋溶解，于4℃冰箱中保存，使用前经0.22 μm滤膜过滤。

2.2.2 透析样品溶液的制备 小鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，固定于脑立体定位仪上。切开头部皮肤，暴露颅骨，于前囟水平向前0.5 mm，水平向下3.5 mm，左右两侧各钻一孔，将透析管植入脑内。在透析管两端距有效透析部位10 mm处，分别粘上一段长15 mm、外径0.7 mm的不锈钢管，用牙科水泥固定于颅骨表面，小鼠苏醒恢复正常后18～24 h进行灌流。调节灌流速度为10 μL/min。弃去前30 min的流出平衡液，以后每10 min收集1个样品，即刻进样。

3 结果

3.1 系统适应性实验 在上述色谱条件下，分别以Ringer's液、标准品溶液和透析样品溶液进样，Uracil的保留时间约为4.5 min，其在标准品溶液和透析样品溶液中保留时间一致。灌流液所形成的溶剂峰不干扰其测定，且与脑内其他物质分离良好。色谱图见图1。

图1 色谱图

3.2 精密度实验 吸取同一标准品溶液20 μL，重复进样5次，测定峰面积。结果Uracil=(6 954± 481)，RSD=0.55，n=5，提示仪器精密度良好。3.3 标准曲线的制备 将标准品溶液稀释，分别制得浓度为 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的标准溶液，测定峰面积，以峰面积Y对其浓度X进行线性回归。制得归一化法标准曲线。U-racil:Y=32 938 X+506.83(R2=0.998 4)。说明尿嘧啶在0.05～1.0 μg/mL范围内线性关系良好。

3.4 体外回收率试验 经体外回收率校正，每15 min测得小鼠正常清醒自由活动状态下纹状体细胞外液Uracil基础水平为(177±65)ng(n=30)。连续检测2 h尿嘧啶水平基本稳定。尿嘧啶体外回收率为8.4%。

3.5 加样回收率 连续透析20 min获取40 μL透析液，吸取20 μL 测定 Uracil含量，另取15 μL的透析液，精密加入Uracil标准品溶液5 μL后进样，结果Uracil的加样回收率为92.1%(RSD=1.52，n=5)。

3.6 稳定性试验 将存有Uracil样品的透析样品放置 －80 ℃冰箱保存，于 0、0.5、1、2、4周时取出测定，37℃水浴溶解后迅速进样3次，考察Uracil冻存稳定性。结果表明，Uracil透析样品在－80℃保存4周稳定。

4 讨论

脑内微透析技术是近20年在国际上发展起来的一种新的生物体内微量取样技术，其优点是可以于清醒状态下，对动物脑中各种递质和其他小分子物质进行连续取样，从而更真实、直接地反映出药物或其他因素的作用或影响［5］。由于透析样品不含大分子物质，所以可直接应用HPLC对其进行分析测定。

在多种中枢神经系统疾病中，都存在着神经递质和神经调质水平的变化，如谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、抗坏血酸(AA)等。近年来，除经典神经递质外，核酸与核苷酸的作用受到越来越多的关注，而尿嘧啶作为脑内主要嘧啶核苷酸之一，在药物成瘾、神经元损伤中的作用已成为近年来研究的焦点。

由于生物样品中物质种类较多，特别是核苷酸分子存在结构相近、最大紫外吸收波长相邻等特点，待测指标的完全分离显得较为困难。本文根据Uracil的水溶性特点，调整流动相配比，减少了有机相，并用磷酸调整pH值，增加极性;降低柱温、流速，以延长保留时间，以上操作在保证检测限的同时，大大提高了分离度，使Uracil得以较好分离。

综上所述，在体微透析结合HPLC紫外检测器可方便快捷地检测脑透析液中Uracil含量，具有简便、快速、准确度好、灵敏度高等特点，为进一步开展中枢系统研究中核苷酸的检测提供方法学基础。

［1］ Cansev M.Uridine and cytidine in the brain:their transport and utilization［J］.Brain Res，2006，52(2):389-397.

［2］ Sprong H，Degroote S，Nilsson T，et al.Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum［J］.Mol Biol Cell，2003，14(8):3482-3493.

［3］ 蔡乐，叶敏，付强，等.HPLC法测定血浆中尿嘧啶和二氢尿嘧啶的含量［J］.中国药物应用与监测，2008，5(6):10-13.

［4］ Wang TL，Wu CF，Yang JY，et al.Effect of morphine on brain uracil release in mouse striatum detected by microdialysis［J］.Neurosci Lett，2009，457(2):89-92.

［5］ 魏宇宁，张盈盈.脑微透析技术在脑内研究中的应用［J］.中国药物应用与监测，2010，7(2):120-123.