郜琪臻，刘 慧，赵亚囡，丁平田*

联苯苄唑是一种新型的氮取代性不含卤素的咪唑类局部抗真菌药，该药物抗菌谱广、抗菌活性高、皮肤渗透力强、疗效确切、作用持久、且毒性低［1］。本药能很好地透过被感染的皮肤，作用迅速且持续时间长，维持时间超过48 h。由于真菌菌丝可侵入角质层深部，因此，抗真菌药制剂的疗效与其经皮渗透能力有关。本试验以小型猪全皮皮肤为模型，应用改良的Franz立式扩散池，对受试联苯苄唑进行了体外经皮透过评价。

1 实验材料

1.1 仪器 透皮扩散试验仪(TK-12B型)，上海铠凯科技贸易有限公司;改良的Franz立式扩散池(有效透过面积3.14 cm2，接受池体积:7 mL，上海铠凯科技贸易有限公司);HPLC色谱仪(SPD-10AVP)，日本岛津;HPLC工作站，YL-clarity(韩国)。

1.2 材料 联苯苄唑原料药(重庆青阳药业有限公司，批号:090505，含量99.1%;由济南三源药业有限公司提供);对照市售联苯苄唑乳膏(拜耳医药保健有限公司，批号:BAT/115976);受试联苯苄唑乳膏(济南三源药业有限公司，批号:20091027);生理盐水注射液(黑龙江七台河制药厂，批号:081225101);其余试剂为市售色谱纯。小型猪(巴马香猪，雄性)，由重庆宗申医达生物技术研发有限公司提供，动物生产许可证号:SCXK(渝)2010-0001。动物使用证:SYXK(渝)2010-0001。

2 方法与结果

2.1 离体皮肤的制备 将小型猪处死，机械法剪毛，剥取皮肤，切皮刀除去多余的脂肪组织，用生理盐水洗干净，放置冰箱(－70℃)中冷藏，备用。

2.2 色谱条件及系统适用性 色谱柱:Chromatorex C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.08 mol/L三乙胺(用磷酸调pH值为7.0)∶乙腈∶甲醇 =15∶17∶68;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:254 nm;进样量:20 μL。

2.3 空白样品的干扰试验 取离体小型猪皮肤，按透皮试验方法进行试验，但是给药池中不加药物，以生理盐水为接受液时，取试验2、10 h的接受液;以PEG400∶生理盐水(1∶2)为接受液时，取试验2、10 h的接受液，过滤后进样测定，HPLC图谱见图1～图3。

图1 生理盐水为接受液时空白样品10 h

图2 PEG400∶生理盐水(1∶2)为接受液时空白样品10 h

图3 联苯苄唑标准品色谱峰

由图3可见，联苯苄唑保留时间为7.87 min，而空白样品溶液在此保留时间无吸收，说明辅料不干扰联苯苄唑测定。由图3计算得到柱效为5 800，高于药典规定的700，符合要求。

2.4 最低检测限 采用企业提供的联苯苄唑原料药为工作对照品，精密称取0.050 6 g(含量99.1%，相当于联苯苄唑0.050 1 g)，加甲醇溶解稀释成浓度为50 μg/mL的溶液，逐步稀释，进样测定，选取HPLC图谱基线噪音3倍者作为最低检测限，进样浓度:0.001 μg/mL，最低检测限 =0.001 μg/mL ×20 μL=2 ×10－5μg。

2.5 标准曲线的绘制 利用最低检测限下配置的50 μg/mL联苯苄唑对照品，用甲醇逐步稀释配制成 1、5、10、25、40 μg/mL 的溶液。每一浓度进样2次进行测定。以对照品的峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程A=38.541 C+7.075 3(r=0.999 9)。结果，联苯苄唑检测浓度的线性范围为1～40 μg/mL。浓度大于该范围的样品用接收介质稀释后，进样测定。

2.6 回收率试验 用甲醇稀释配制 5、25、50 μg/mL联苯苄唑溶液，每种浓度分别配3份，按色谱条件每种浓度连续进样3次，用标准曲线计算药量，计算回收率，回收率在98% ～102%之间，见表1。

表1 回收率测定结果(n=9)

2.7 精密度试验 回收率测定所用样品溶液，每种浓度测定3次，计算高、中、低不同浓度的精密度，结果见表2。结果显示精密度良好。

表2 精密度测定结果

2.8 稳定性试验 取联苯苄唑试验样品溶液(50.1 μg)，于室温下放置，并于 0、2、3、4、5 h 按以上色谱条件进样测定。结果显示，联苯苄唑峰面积无明显变化，表明样品溶液在5 h内基本稳定。见表3。

表3 样品溶液稳定性试验结果

2.9 体外经皮扩散试验

2.9.1 接受介质的确定 在体外经皮试验中，文献中最常用的接受液是生理盐水和磷酸盐缓冲液(PBS)，理想的接受介质应当可以准确模拟被测化合物的体内经皮吸收条件。一般来说，在接受液中，药物的浓度不能超过其饱和溶解度的10%(即应该满足漏槽条件)，接受液浓度过高能导致吸收速率降低，进而导致过低估计了其在体吸收。一般认为，一个化合物在某水性溶液中的溶解度如果低于10 μg/mL，则不能用该溶液做接受液，有必要在接受介质中加入增溶剂［14］。

因为联苯苄唑是难溶性药物，因此，我们首先考察药物在生理盐水、丙二醇∶生理盐水(1∶2)以及PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液中的溶解度，以确定接受介质。

称取联苯苄唑原料药约1 g，至30 mL磨口三角瓶中，加入接受液25 mL，使溶液中始终保持有固体药物存在，将此溶液置于37℃恒温水浴中，100 rpm磁力搅拌，定时取样1 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，进样20 μL用HPLC测定含量，按标准曲线方程计算联苯苄唑的浓度，超过标准曲线范围的样品，用各自接受介质稀释后进样测定。每种介质平行做2份试验。分别测定3、5、10 h的溶解度，以确定所选的介质是否可以满足漏槽条件。联苯苄唑在PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液中溶解度稀释20倍后进样测定。见表4。

表4 联苯苄唑在生理盐水及丙二醇∶生理盐水(1∶2)、PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液中溶解度(37℃，μg/mL)

由表4可见，联苯苄唑在丙二醇∶生理盐水(1∶2)混合液中溶解度约为2 μg/mL;在生理盐水中的溶解度约为1 μg/mL;在PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液中约为 400 μg/mL(＞10 μg/mL)。由于联苯苄唑在丙二醇∶生理盐水(1∶2)混合液中溶解度很低，不符合漏槽条件，笔者选用生理盐水和PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液作为透皮吸收的接受液，分别考察药物的经皮透过性。

2.9.2 透皮试验 采用改良的Franz立式扩散池进行试验，本法是目前文献中较常见的局部用制剂的体外透过性研究方法，一般认为是一种简单、重现性好的试验方法［2］。

扩散池由给药池和接收池组成，将皮肤固定在供给池与接收池之间，将角质层面向给药池一侧，供给池中加入被测制剂(联苯苄唑乳膏0.5 g)，轻轻涂抹，使乳剂均匀分布于皮肤上。接收池中加入7 mL的接受液，供给池底部凹槽中放入磁力搅拌子，搅拌速度100 rpm，温度(37±0.5)℃。开始试验后，于1、2、3、4、6、8、10 h 定时取样，每次吸取2 mL接受液，随即补等量的接受液，样品溶液过滤后，利用HPLC测定药物浓度。按分析方法项下色谱条件进样，测得峰面积后，根据标准曲线计算浓度，再根据接受池液体积和有效扩散面积，按下面的公式计算单位面积(cm2)的累积透皮量(Qn)。

式中，Ci为第i点测得的药物浓度(μg/mL);V为接受池液的总体积(7.0 mL);Vi为每次取样的体积(2.0 mL);S为渗透面积(3.14 cm2)。受试联苯苄唑乳膏和对照联苯苄唑乳膏(市售)分别以生理盐水、PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液为接受液测定经皮透过性。在生理盐水接受液的条件下，对照联苯苄唑乳膏样品和受试样品均不能透过离体的小型猪皮肤。在 PEG400∶生理盐水(1∶2)接收液条件下有微量透过，试验结果见表5～表8;可以看出，10 h的累积透过量受试联苯苄唑乳膏为(0.286±0.100)μg/cm2，对照联苯苄唑乳膏为(0.269±0.033)μg/cm2;二者经皮透过曲线基本一致，见图4。所以，可以证明受试联苯苄唑乳膏和对照联苯苄唑乳膏在经皮透过性上没有差异。

表5 受试联苯苄唑乳膏经皮透过性测定结果［PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液为接受液，μg/mL］

表6 受试联苯苄唑乳膏经皮累积透过量［PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液为接受液，μg/cm2］

表7 对照联苯苄唑乳膏经皮透过性测定结果［PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液为接受液，μg/mL］

3 讨论

中国药典2005年版用甲醇∶水∶四氢呋喃(体积比为84∶5∶1)作测定乳膏中联苯苄唑的流动相，并规定了理论塔板数不得低于700。实验中发现采用这一流动相测定时，联苯苄唑的最低检测限0.01 μg(0.5 μg/mL ×20 μL)，不够灵敏且色谱峰变宽。因此，本文本试验参照文献［3-6］，并经试验确定，以pH7.0三乙胺磷酸盐缓冲液∶乙腈∶甲醇(15∶17∶68)为流动相，采用ODSC18色谱柱，可有效减少ODS色谱柱硅醇基引起的药物拖尾现象，而且测试时间相对较短。

表8 对照联苯苄唑乳膏经皮累积透过量［PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液为接受液，μg/cm2］

图4 联苯苄唑乳膏经皮透过性测定曲线(PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液为接受液)

透皮实验中，接受介质的确定是较关键的一步。在接受液中，药物浓度应满足漏槽条件。由于联苯苄唑是难溶药物，本实验首先考察药物在生理盐水、丙二醇∶生理盐水(1∶2)以及PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液中的溶解度，以确定接受介质。实验时，注意使溶液中始终保持有固体药物存在，即确保溶液达到饱和状态。溶解度大的介质(PEG400∶生理盐水(1∶2)混合液)可以满足漏槽条件;虽然联苯苄唑在生理盐水中的溶解度很低，只有1 μg/mL左右，但是在透过性试验中证明并没有药物透过，所以也符合漏槽条件，而且生理盐水中因为没有添加外来物质，更能代表在体的真实情况，因此，选择这两种介质合理可行。

［1］ 罗东辉，袁承晏.联苯苄唑的药效学研究实验室抗真菌活性测定［J］.重庆医科大学学报，1990，15(4):26.

［2］ 郑俊民.经皮给药新剂型［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，2006:265.

［3］ 荣蓉，陈继平，刘淑琴，等.联苯苄唑乳胶剂的制备及质量考察［J］.中国药剂学杂志，2008，6(5):219.

［4］ 王艳，徐晖，刘玉强，等.HPLC法测定乳膏中联苯苄唑和醋酸曲安奈德的含量［J］.中国新药杂志，2007，16(8):631.

［5］ 郭兴杰，魏宗有，李发美.高效液相色谱法测定乳膏剂中的联苯苄唑［J］.色谱，2001，19(3):289.

［6］ 张天虹，徐文，崔升淼，等.高效液相色谱法测定联苯苄唑凝胶中联苯苄唑的含量［J］.辽宁药物与临床，2003，6(4):174-175.