朱少平，赵金平，毛志福，黄 杰，王君钰，周雪峰，徐 明

肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)异常增殖是肺动脉高压(PAH)的常见病理特征，其直接后果是导致肺动脉分支狭窄甚至闭塞，肺循环阻力增高［1］。PAH患者和动物模型中5-羟色胺(Serotonin，5-hydroxytryptamine，5-HT)异常增高，是触发PAH的重要因素之一，其在PAH的病理发生和演变过程中担当着不可忽视的角色。5-HT是一种肺血管收缩剂和促有丝分裂剂，其促有丝分裂效应的实现主要依赖于一种与其具有高亲和力的5-HT转运体(5-HT transporter，5-HTT)。有研究表明，5-HTT抑制剂能逆转野百合碱诱导的大鼠PAH［2］，提示5-HTT的活性与PAH动物模型中肺血管重构密切相关。本研究拟通过观察5-HTT抑制剂氟西汀对离体PASMC体外增殖的影响，以期为5-HTT抑制剂治疗PAH提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Wistar大鼠(二级雄性，7周龄，湖北省实验动物中心提供)。氟西汀(Fluoxetine，Sigma，美国)，野百合碱(MCT，Sigma)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma)。酶标仪(BIO-TEK，美国)，流式细胞仪(贝克曼库尔特，美国)，高速离心机(金坛市医疗仪器厂，中国)，凝胶成像分析系统(UVP，美国)

1.2 方法

1.2.1 大鼠PASMCs制备与分组 大鼠PASMC原代分离、培养方法采用组织块贴壁法［3］，50 mL培养瓶常规细胞培养PASMC至亚融合状态，0.5 mL 0.25%的胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞部分脱壁时，即加含有10%小牛血清的培养基终止消化，吹打制成单细胞悬液，以血细胞计数板计数细胞，调整PASMC悬液浓度为1×104/mL，以每孔100 μL接种于96孔培养板，待细胞贴壁生长后，弃原培养液，PBS洗2次后分组(见表1)。

表1 实验分组设计

5-HT+Flu组另分为5 个亚组:A、B、C、D、E，各亚组中分别加入 Flu终浓度为 5、10、20、40、80 μg/mL的培养液100μL，每组设6个复孔，连续培养24、48、72 h，根据细胞生长情况，每24 ～48 h 左右换培养液1次。

1.2.2 抗平滑肌肌动蛋白α-actin免疫细胞化学染色 将平滑肌细胞制成细胞爬片后，冷丙酮固定10 min，PBS冲洗3遍，后续操作依照链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(S-P法)试剂盒进行。

1.2.3 MTT比色法细胞数目测定 在96孔平底细胞培养板接种浓度约为1×104/mL的PASMC，100 μL/孔，用含10%胎牛血清的DMEM补到200 μL，在常规条件下培养24 h(37℃，5%CO2)后，换无血清的DMEM培养基，同步化24 h后，分别于 24、48、72 h 每孔加入20 μL MTT 溶液;将培养板移入37℃、5%CO2及饱和湿度的温箱内静置5 h，弃培养液，然后每孔加100 μL预先配制的DMSO溶液，微振荡器上振荡10 min混匀，继续培养3 h，使MTT结晶完全溶解，用酶标仪测定490 nm波长处各孔的吸光度值A490，取各复孔A490值的平均值作为统计数据。

1.2.4 流式细胞仪检测(FCM) 选择第4～6代生长良好的大鼠PASMC，按1×104/mL的浓度接种入6孔平底塑料培养板，将培养液换为无血清的DMEM培养24 h(37℃，5%CO2)，使细胞同步化后，分别于 48、72 h消化收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS漂洗，过滤，调整单细胞悬液浓度为1×106/mL;1 000 r/min离心5 min，PBS漂洗，200目滤网过滤，调整单细胞悬液浓度为1×106/mL，离心，弃上清液;PBS漂洗2次，每管加入70%预冷乙醇1.5 mL固定，并用Tip头轻轻混匀，－20℃固定过夜后离心弃乙醇，用PBS洗涤2次;留取细胞悬液 50 μL，加入终浓度为1 mg/mL的 RNase 100 μL，于37 ℃水浴30 min，立即置于冰水浴中;加入终浓度为500 μg/mL的PI染液50 μL，避光染色30 min，4 h内转入 FCM 测量管上流式细胞仪检测。

1.2.5 统计分析 采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析，组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 显微镜下观察 在倒置光学显微镜下，大鼠PASMC呈梭型，细胞中心有深染的卵圆形细胞核(见图1)，细胞生长呈现出分布不均匀的“峰－谷”样特征。免疫组化S-P法做α-actin抗体免疫组化染色，可见细胞胞浆中呈现棕色深染颗粒(见图2)。

图1 传代培养的PASMC，呈现典型“峰-谷”特征(箭头)(HE×100)

图2 PASMC α-actin阳性表达(箭头)(SP×400)

2.2 各组PASMC细胞周期分析结果比较 FCM细胞周期分析结果表明，各组细胞培养48 h后，5-HT组细胞S期细胞比例［(43.36±1.04)%］较Control组［(24.76±1.02)%］明显上升，G0/G1期细胞比例［(51.54±1.13)%］较 Control组［(69.35±1.04)%］明显下降(P＜0.01)。Flu组(Flu浓度为10 μg/mL)48 h后与Control组比较，二者在G0/G1期、S期细胞百分数上差异无统计学意义。48 h后，5-HT+Flu组与5-HT组PASMC细胞周期分布情况比较，G0/G1期细胞比例较Control组明显上升，而S期细胞比例较Control组明显下降(P＜0.01)，5-HT+Flu组与Control组对应值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)(见表2)。

表2 培养72 h后各组对PASMC细胞周期的影响(n=6)

2.3 不同浓度Flu对PASMC增殖的影响 5-HT组(Flu 0 μg/mL)细胞培养48 h后，A490值较 Control组明显增加，至72 h时，两组比较，P＜0.01。PASMC培养24 h后，未观察到不同Flu浓度组之间A490值差异存在统计学意义。48 h后，Flu浓度为20 μg/mL时，该组 A490值较5-HT组显著降低(P＜0.05)，且随着Flu浓度递增，A490值进一步下降，当Flu浓度为80 μg/mL时，该组A490值与5-HT组对应值比较，P＜0.01，至72 h末，上述变化趋势更明显(见表3)。

表3 不同浓度Flu在各时间点对PASMC增殖(A490)的影响

3 讨论

5-HT对肺动脉具有强大的促收缩功能，目前研究表明，5-HT在PAH肺血管重构中担当重要角色，其机制之一为促进平滑肌细胞迁移和增生［4］。PAH患者血液中5-HT水平高于正常，已得到多数实验结果的证实［5-7］，提示5-HT与人类PAH的病理发生过程密切相关。

本实验中采用5-HT对体外培养的PASMC细胞进行干预，48 h该组细胞A490值与空白对照组相比显著升高，而Flu及5-HT+Flu组细胞此时未观察到这一现象，提示5-HT在体外对PASMC具有明显的刺激作用。5-HT+Flu组细胞在给予5-HT刺激的同时，分别给予浓度范围5～80 μg/mL的氟西汀干预，通过比较不同时间和不同Flu浓度的PASMC A490值，随着浓度的增高或时间的延长，A490较对照组逐渐降低，提示氟西汀对体外5-HT刺激所致的PASMC增殖的抑制作用具有浓度依赖性。细胞周期分析显示，氟西汀作用于PASMC 72 h后，细胞周期分布表现为S期细胞比例下降，G0/G1期细胞比例上升，提示氟西汀抑制PASMC增殖主要是通过抑制DNA复制实现的。

长期服用食欲抑制剂可以拮抗5-HTT，从而使血浆及下丘脑5-HT水平增加。既往研究表明，该作用与PAH危险性增加有关［8-9］。19世纪30年代，食欲抑制剂延胡索酸的应用使欧洲PAH患病人群明显增加，随后，类似药物如右旋酚氟拉明的应用同样被证实与PAH发病增加有关［10］。然而，其他药物如选择性5-羟色胺重摄取抑制剂虽然增加血浆5-HT水平，但似乎并未增加PAH发病的危险性［11］，提示尚有其他未知因素参与PAH的病理过程。

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