李海鹏 杨东升 王立丰 关尚一 丁树哲 卢健

1 上海体育学院运动科学学院（上海 200438）

2 华东师范大学体育与健康学院

3 浙江工业大学体质健康研究中心

Sarcopenia（肌肉衰减征，又称肌力流失）是一种以骨骼肌质量减少、肌肉力量及耐力显著下降为主要特征的衰老性机能减退，严重影响老年人生活质量[1，2]。有研究表明，Sarcopenia的发生涉及细胞凋亡、蛋白合成减少、激素分泌不足、运动神经元失能等多种因素，其中细胞凋亡机制逐渐成为归因研究的焦点，而细胞凋亡的调控中心——线粒体则通过Caspase依赖与非依赖性两条途径介导细胞凋亡[3，4]。

Kim等曾提出耐力运动能延缓Sarcopenia发生[5]。运动作为特殊应激手段，对Sarcopenia的发生所产生影响的机制有待阐明。目前，运动对骨骼肌细胞凋亡的影响已有不少研究，而运动对衰老骨骼肌细胞凋亡以及凋亡信号途径中相关凋亡基因的影响却罕见实证报道[6]。大多数研究者仅以综述形式进行了报道，而即使有实证研究，也多局限于检测衰老骨骼肌凋亡相关调节基因（Bcl-2和Bax）的变化，忽略了凋亡途径中各凋亡基因可能存在的各向异性的真实事件，不能真正阐释不同途径中凋亡基因在运动干预后的变化。本实验以快速老化小鼠（SAMP8）为研究对象，初步探究跑台运动对小鼠骨骼肌Caspase依赖与非依赖性细胞凋亡信号途径中各凋亡基因mRNA水平的影响，为运动预防Sarcopenia的理论提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性快速老化（SAMP8系）小鼠30只，购自天津中医药大学第一附属医院实验动物中心（实验动物饲养许可证编号：W-J津实动质M准字第006号）。购入后于华东师范大学实验中心动物房IVC独立送风饲养系统中在SPF（Specific pathogenfree）条件下分笼饲养，以国家标准啮齿类饲料喂养，饲料购自上海斯莱克实验动物公司[许可证号：SCXK（沪）2007−0005]。自由饮食、饮水。自然光照并遵循明暗周期，温度范围20 ± 2℃，相对湿度55±5%。实验动物分组等情况见表1。

1.2 运动方案

表1 实验动物分组及饲养和训练情况

适应性饲养1周后OE组（30周龄时）开始，采用动物跑台进行耐力训练。训练时间选择在暗周期（18:00～20:00），每天1次，每周5天。参照Bedford与Siu的方案[7，8]，随动物运动具体情况适时调整。第1周速度为15 m/min，时间15 min；第2周为20 m/min×25 min；第3周为25 m/min×25 min；第4周为25 m/min×30 min；第5～8周均为30 m/min×30 min。

1.3 取材及计算SI

末次跑台运动后24～48 h，小鼠断头处死，迅速取完整后肢腓肠肌，称量肌肉重量，锡箔纸包裹并标记后迅速置于液氮中，后转移至-80℃超低温冰箱保存备测。选用Edstrom提出的靶骨骼肌的质量（mg）/受试体重（g）求得 Sarcopenia Index（SI）值，并以此作为评价指标[9]，并参照Baumgartner等的方法[10]（老年组SI值与青年组相比显著降低，且差异大于2倍SD）进行判定。

1.4 RNA提取及鉴定

取腓肠肌样品100 mg左右，参照Trizol试剂盒（购自Invitrogen 公司）说明书抽提RNA。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法（OD260/OD280）对RNA的完整性和纯度进行检测，确认28s、18s、5s三条带以及OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间。

1.5 RNA逆转录

取 RNA 2 μl以 Oligo（dT）15（50 pmol/μl）为随机引物合成cDNA。M-MLV试剂盒购自Promega公司。

1.6 实时荧光定量PCR

查找目的基因全序列，采用Primer Express 3.0设计软件设计引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，相关信息见表2。

Realtime PCR反应体系为20 μl，其中SYBR Premix（TOYOBO公司）10 μl，前向引物和反向引物（10 μM）各 1 μl，模板 4 μl，其余用无 RNase水补足。反应条件为Stage 1：（1×）95℃，3 min；Stage 2：（45×）Step 1：95 ℃，20 s，Step 2：Tm，20 s，Step 3：72 ℃，20 s（收集荧光）；Stage 3：（1×）95℃，1 min；Tm，20 s；缓慢升温（收集荧光）至95℃，10 s。经仪器自动分析，各基因融解曲线（Melt Curve）均为单峰，表明扩增产物特异性较高。以β-actin为内参基因，各目的基因相对量（Relative Expression，RE）按 2－ΔΔCt计算求得。

1.7 统计学分析

采用SPSS for windows15.0统计软件包进行数据处理，结果以表示，利用独立样本t检验分析组间差异，显著性水平为P < 0.05。

2 结果

2.1 SI值

OC组SI值（3.84±0.39 mg/g）较YC组SI值（4.54±0.24 mg/g）显著下降（P < 0.05），且下降幅度大于2倍SD；OE组SI值（3.90 ± 0.62 mg/g）较OC组无显著性差异（P > 0.05）。

2.2 骨骼肌Caspase依赖性凋亡通路中凋亡基因表达

表3显示，与YC组相比，OC组apaf-1和Caspase-3 mRNA表达显著上调（P < 0.05），Cyt C和Caspase-9 mRNA表达未见明显变化（P > 0.05）。与OC组相比，OE组CytC mRNA表达显著上调（P< 0.05），Caspase-3 mRNA 表达显著下调（P < 0.05），apaf-1和Caspase-9 mRNA表达未见明显变化（P >0.05）。

表3 各组Caspase依赖性凋亡基因mRNA表达

2.3 骨骼肌Caspase非依赖性凋亡通路中凋亡基因表达

表4显 示， 与YC组 相 比，OC组PARP mRNA表达显著上调（P < 0.05），AIF mRNA表达显著下调（P < 0.05），Endo G mRNA表达无明显变化（P > 0.05）。与OC组相比，OE组PARP mRNA表达显著下调（P < 0.05），AIF mRNA表达显著上调（P < 0.05），Endo G mRNA表达无明显变化（P > 0.05）。

表4 各组Caspase非依赖性凋亡基因mRNA的表达

3 讨论

SAMP8小鼠是一类正常发育和成熟后显示衰老加速效应的近交系小鼠，一般寿命约为358天（约51周龄），其在生长期（16～24周龄）与普通纯种小鼠无异，但在度过生长期后迅速出现老化特征。故本实验OC组及OE组SAMP8小鼠（38周龄）均已步入老年阶段。OC组小鼠腓肠肌SI值较YC组小鼠显著降低，且降幅达2倍SD以上，提示SAMP8小鼠已表现出Sarcopenia症状，这与Derave的研究结果一致[11]；然而，与OC组相比，OE组SI值未见明显变化，提示跑台运动未能有效增加Sarcopenia小鼠SI值。

本研究结果显示，与YC组相比，OC组小鼠腓肠肌apaf-1、Caspase-3和PARP mRNA均显著上调，AIF mRNA表达显著下调，而Cyt C、Caspase-9和Endo G mRNA表达未见显著变化。这提示虽然Caspase-3、AIF和Endo G均可诱导细胞凋亡，但较之Caspase非依赖性凋亡途径，在Sarcopenia发生发展过程中，Caspase-3诱导的Caspase依赖性细胞凋亡途径可能随衰老进程逐渐占据主导地位，而AIF（apoptosis inducing factor，凋亡诱导因子）和Endo G （Endonuclease G，核酸内切酶G ）诱导的Caspase非依赖性细胞凋亡途径则可能表现为凋亡潜能随衰老进程呈现各向异性。值得注意的是，Baker等研究发现，随衰老进程，F344×BN （Fischer344 × Brown Norway）大鼠跖肌Caspase-3和AIF mRNA表达均显著上调，且Caspase-3和AIF表达均与Sarcopenia的发生进程高度相关[12]。此外，Marzetti等观察到老年F344×BN大鼠腓肠肌AIF和Endo G表达显著上调，而Cyt C未见随衰老进程出现显著变化，由此该研究者认为，线粒体介导的Caspase非依赖性细胞凋亡信号途径较Caspase依赖性细胞凋亡信号途径在Sarcopenia的发生进程中发挥更重要的作用[13]。但以上研究结果与本研究结果大相径庭，其原因可能是Sarcopenia在骨骼肌衰老进程中对凋亡途径的选择可能有一定的物种差异性。鉴于目前国内尚无F344×BN大鼠种源的提供，因而只能选取较理想的SAMP8小鼠进行研究，这也提示Sarcopenia发生机制的凋亡归因不能一概而论。Pistilli研究认为，虽然促凋亡环境可能导致衰老性骨骼肌萎缩，但具体凋亡途径可能因衰老程度以及实验动物等因素不同而存在差异[14]。这为本文的实验结果提供了有效的解释依据。

本研究中，跑台运动显著上调了腓肠肌Cyt C和AIF mRNA表达，显著下调了Caspase-3和PARP mRNA表达，而apaf-1、Caspase-9和Endo G mRNA未见明显变化，提示正常情况下，Cyt C和AIF均被限制在线粒体间隙内，当受到凋亡信号刺激时，Cyt C和AIF分子可从线粒体释放到细胞浆中，其中Cyt C通过与apaf-1、Procaspase-9以及ATP等形成凋亡小体诱导Caspase依赖性凋亡，而AIF可再通过核定位信号转位到细胞核中，在细胞核中结合DNA并激活染色体凝聚，引起DNA呈大片段断裂，导致细胞凋亡。而在运动干预下，由于磷酸原供能系统主要参与运动供能，可能导致细胞内ATP稳态失衡，虽然Cyt C有所上调，但不能形成功能完整的凋亡小体复合物，从而无法诱导激活凋亡效应子——Caspase-3表达。本研究中Caspase-3下调则可能由独立于线粒体之外的其他途径完成，并在一定程度上对衰老骨骼肌萎缩起保护作用[15]。Song等的研究结果显示，12周跑台运动显著下调老年大鼠腓肠肌Caspase-3表达，并弱化促凋亡信号，进而缓解衰老骨骼肌萎缩[16]。而本研究中，虽然运动对Caspase依赖性凋亡途径有所抑制，进而保护衰老骨骼肌进一步萎缩，但AIF诱导的Caspase非依赖性细胞凋亡途径却在运动过程中逐渐占据主导地位，进一步诱导衰老骨骼肌通过该途径进入细胞凋亡程序，而Caspase非依赖性的另一凋亡诱导因子——Endo G依旧表现为凋亡沉默。由此可见，细胞凋亡可由不同的信号转导途径介导，即信号转导途径决定细胞命运[17]。一方面，不同信号传导系统在不同细胞中对细胞凋亡的调控作用不同，或启动或阻碍细胞凋亡；另一方面，同一信号传导系统在不同组织/细胞中对细胞凋亡的影响存在强弱差异，甚至相反的作用。

4 总结

与Caspase非依赖性凋亡途径相比，Caspase依赖性凋亡途径在Sarcopenia的发生中发挥更重要的作用；跑台运动在一定程度上能弱化衰老骨骼肌Caspase依赖性凋亡通路的促凋亡基因mRNA表达，但对AIF诱导的Caspase非依赖性凋亡基因mRNA的表达却呈现上调作用。

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