孙远征,卫哲,马俊,王明明

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

·动物实验·

电针对吗啡戒断后焦虑大鼠行为和DA含量变化的影响

孙远征1,卫哲1,马俊2,王明明2

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

【摘要】目的观察电针对吗啡戒断后焦虑SD大鼠的作用和相关脑区DA递质的影响。方法采用逐日递增法,皮下注射吗啡形成大鼠依赖后,注射纳洛酮快速戒断,建立吗啡依赖戒断模型。采用高架十字迷宫测定大鼠焦虑程度,观察电针对脑内DA神经递质含量的影响。结果电针可显著提高吗啡戒断后焦虑模型大鼠OE%、OT%值(P＜0.01);电针能降低吗啡戒断后SD大鼠脑组织的DA含量(P＜0.05)。结论电针可以改善吗啡戒断后大鼠的戒断症状,抑制吗啡戒断后所致焦虑症状,其机制可能与电针调节吗啡戒断后大鼠脑内DA含量有关。

【关键词】电针;吗啡戒断;多巴胺;大鼠

吗啡依赖在世界范围的蔓延泛滥并成为世界性公害,给个人、家庭、社会带来了巨大损害,戒毒治疗已成为国内外医学界研究的热点。中脑边缘多巴胺系统作为药物成瘾的神经生物学基础,是目前公认的与成瘾有关的最重要的脑区[1]。该系统起自中脑腹侧被盖区(Ventral Tegmental Area,VTA)向伏隔核(Nucleus Accum-bens,NAc)的投射[2]。焦虑是对阿片类物质依赖者所反映的重要戒断症状。临床研究已证实,针灸戒毒作为一种有效的治疗手段,具有治疗安全,无毒副反应,可抑制戒断症状,易为患者接受等优点,在全世界得到快速推广[3]。电针可以改善戒断症状,目前多为电针治疗单一穴位对吗啡戒断后症状的研究。本研究通过建立吗啡戒断后大鼠模型,优化穴位选择,观察电针对吗啡戒断后焦虑大鼠的影响,进一步探讨电针治疗吗啡戒断后的中枢作用机制。

1　材料与方法

1.1研究对象

选用SD大鼠50只,雄性,体重180～220 g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。动物在实验前驯养1周,动物房温度、湿度分别维持在20℃、70%左右。

1.2试剂与仪器

盐酸吗啡注射液(morphine hydrochloride)由沈阳第一制药厂提供;盐酸纳络酮注射液(naloxone, NLX)由成都倍特药业有限公司提供;DA酶联免疫检测试剂盒(R&D);戊二醛(上海生物工程有限公司);多聚甲醛(分析纯,上海溶剂厂);酶标仪、高架十字迷宫、KWD808Ⅱ脉冲治疗仪。

1.3造模方法

参照文献[4]进行造模,建立吗啡戒断后大鼠模型。采用逐日递增法背部皮下注射盐酸吗啡注射液(20 mg /kg,30 mg/kg,40 mg/kg,50 mg/kg),2次/d (8 am,4 pm),连续5 d。于末次注射吗啡后3 h给予纳络酮腹腔注射(3 mg/kg)快速戒断,随即将大鼠置于3000 mL烧杯中,观察10 min内大鼠的跳跃、舔阴、竖立、湿抖、洗脸等戒断反应,将吗啡依赖戒断大鼠作为模型动物。戒断反应观察参照Maldonade等的方法,观察湿狗样颤抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳跃、齿颤、上睑下垂、流涎、腹泻等戒断症状,根据其评分标准进行评分,记录可数症状在观察时间内发生的次数,按戒断症状评分标准进行评分。不可数症状包括上睑下垂、流涎、腹泻。2 min评定1次上睑下垂,其他不可数症状按严重程度进行评分,无症状评为 0分,轻度1分,严重2分。全部症状得分之和为戒断总分。详见表1。

表1　戒断症状评分标准

1.4动物分组与处理

将SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组和手针组,每组10只,共40只。各组相同时间、相同方法注射生理盐水,连续5 d,2次/d,第6天催瘾后开始同模针组相同方法固定;模型组按上述方法造模,第6天催瘾后开始同模针组相同方法固定;电针组第 6天催瘾后开始予电针治疗,按照《中国兽医针灸学》及《实验针灸学》取百会、双侧肾俞、三阴交、足三里穴,接电针治疗仪(疏密波,频率 2/ 100 Hz),以小鼠下肢针刺侧轻微抖动为度,15 min/次,1次/d,连续治疗6 d;手针组第 6天催瘾后开始予针刺治疗,取穴方法同电针组,得气后留针15 min。

1.5高架十字迷宫实验

治疗结束后采用高架十字迷宫自动录像监测系统观测动物活动情况。每只动物测试5 min,各组同步交替进行。具体方法为,测试前将每只小鼠依次放入60 cm×60 cm×35 cm塑料盒中,盒底颜色、质地与迷宫一致。待小鼠适应5 min后,轻柔抓起并置于迷宫中央区,使其头部正对一个开臂,随即记录5 min内小鼠分别进入开臂与闭臂的次数和滞留时间,计算各组小鼠在开臂滞留时间(Open-arms Time,OT)和进入开臂次数(Open-arms Entries,OE)分别占两臂滞留总时间和进入两臂总次数的百分比(OE%和 OT%),以小鼠四爪均进入开臂或闭臂为进臂一次的标准[5]。

1.6灌注取材

各实验组大鼠治疗结束后第二天,腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg),麻醉后开胸,于右心房和左心室心尖部各做一切口,进行主动脉插管快速灌注冲洗液200～250 mL(每 100 mL含氯化钠 0.85 g,氯化钾0.025 g,碳酸氢钠0.02 g),随后用300 mL含0.5%戊二醛、4%多聚甲醛和 0.l mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)的固定液进行灌注固定,开颅,完整取出全脑组织,分离VTA、NAc,部分置入上述固定液中固定过夜。

1.7ELISA法检测大鼠脑区DA含量

取液氮中冻存的VTA和NAc脑区,每例取脑组织0.1 g,用生理盐水制成10%的组织匀浆备用,具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。测定每升脑组织匀浆中DA的量,单位为mmol/L。

1.8统计学方法

所有数据均由SPSS统计软件处理。采用单因素方差分析、q检验。数据以±s表示,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组吗啡依赖大鼠戒断症状比较

在实验中观察到,除空白组外,其余各组大鼠经纳洛酮催促后出现站立、激惹、齿颤、湿狗样颤抖、烦躁不安、上睑下垂、跳跃、清理皮毛等戒断症状,模型组、电针组和手针组与空白组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01),而空白组无明显戒断症状,说明动物模型建立成功。详见表2。

表2　各组吗啡依赖大鼠戒断症状比较　(±s,分)

表2　各组吗啡依赖大鼠戒断症状比较　(±s,分)

注:与空白组比较1)P＜0.01

组别 　n 　戒断症状评分值空白组 　10 　0.3±0.48模型组 　10 　20.5±4.161)电针组 　10 　19.4±4.921)手针组 　10 　20.6±6.811)

2.2各组大鼠高架十字迷宫测试结果比较

模型组 OT%、OE%值与空白组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01);电针组OT%、OE%值与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01);手针组OT%、OE%值与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结果表明,吗啡戒断后大鼠出现明显的焦虑状态,造模成功;针灸可以减轻吗啡戒断后模型大鼠焦虑情绪,电针组疗效显著。详见表3。

表3　各组大鼠高架十字迷宫测试结果比较　(±s)

表3　各组大鼠高架十字迷宫测试结果比较　(±s)

注:与空白组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01,3)P＜0.05

组别 　n 　OT% 　OE%空白组 　10 　58.32±14.23 　59.64±7.58模型组 　10 　22.74±16.901)　28.49±19.231)电针组 　10 　46.78±10.702)　49.36±11.542)手针组 　10 　38.15±10.343)　42.69±9.433)

2.3各组大鼠脑区DA含量比较

采用ELISA法测定各组大鼠相关脑区DA含量的变化。模型组、电针组和手针组的 VTA和NAc脑区DA含量与空白组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。电针组、手针组的VTA和NAc脑区DA含量与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05),提示针灸可以降低吗啡戒断后大鼠脑区 DA含量,以降低NAc的DA含量为主。详见表4。

表4　各组大鼠脑区DA含量比较　(±s,ng/L)

表4　各组大鼠脑区DA含量比较　(±s,ng/L)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 　n 　VTA 　NAc空白组 　10 　403.13±34.25 　382.18±20.56模型组 　10 　649.78±47.451)　639.73±28.671)电针组 　10 　489.34±27.451)2)　439.3±23.571)2)手针组 　10 　538.65±41.681)2)　497.32±31.681)2)

3　讨论

复吸是药物成瘾的共同特征,药物成瘾后的戒断症状导致复吸率长期居高不下,中医药戒毒方法已经日益受到重视,针灸治疗药物成瘾后戒断综合征取得了一定的疗效[6]。阿片使用后中脑边缘DA系统功能的改变一直是阿片依赖及戒断形成机制的重点。本实验以逐日递增法形成吗啡依赖大鼠模型,腹腔注射纳洛酮催促戒断后,通过戒断症状评分确立吗啡依赖后戒断大鼠模型。结果显示,电针可以显著提高吗啡戒断后焦虑模型大鼠的 OE%、OT%值(P＜0.01)。电针组、手针组与模型组相比,可以降低吗啡戒断后大鼠相关脑区DA含量(P＜0.05),以电针组为著。结果表明,电针可以减轻吗啡戒断后大鼠焦虑状态,其机制可能与电针调节吗啡戒断后大鼠脑内DA的释放有关。

阿片类物质成瘾后戒断综合征主要以肝、脾、肾三脏阴液不足阴虚火旺为根本病机改变[7]。而在戒断症状中出现率最高的焦躁不安、失眠、渴求药物及自汗,多属阴阳两虚或气阴两虚而以阳虚或气虚为主要表现。有研究发现[8],不同频率电针可以释放中枢不同种类的神经肽和神经递质。本实验选取高频与低频交替的疏密波(2/100 Hz),对于身体依赖和精神依赖均有确切的治疗作用。以往研究发现[9],电针“足三里”穴可以使吗啡戒断大鼠β-EP含量增加,提高机体免疫功能。针刺“三阴交”穴可以降低吗啡戒断大鼠脑内NE含量[10]。艾灸关元可促进吗啡依赖小鼠体质量增加,淋巴细胞转化增强,提高免疫功能[11]。本研究根据经络穴位特性,选取百会、肾俞、足三里、三阴交穴,各穴位联合应用能激发经气,促使气血周身流动,理气清热化痰,开窍醒神,滋阴温阳,使失调的阴阳趋于平衡,可以更好地改善戒断综合征的病机变化,缓解戒断症状。

针灸在促进脱毒上具有很大的应用潜力和前景,值得进一步关注与研究。本实验初步分析电针对吗啡戒断后焦虑大鼠的影响,其改善焦虑的作用可能与调节体内DA神经递质有关,但目前尚缺乏实验的大样本研究,并且同时应该加强穴位配伍、针刺手法等方面的深入研究,进一步探讨针灸防复吸的中枢作用机制,从而充分发挥中医药戒毒优势。

参考文献

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI:10.3969/j.issn.1005-0957.2011.05.337

文章编号:1005-0957(2011)05-0337-03

收稿日期2010-07-21

作者简介:孙远征(1957 - ),男,主任医师

Effect of Electroacupuncture on Behavior and DA Content in Rats with Morphine Withdrawal-induced Anxiety

SUN Yuan-zheng1, WEI Zhe1, MA Jun2, WANG Ming-ming2.1.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China; 2.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on behavior and correlative brain area neurotransmitter DA in rats with morphine withdrawal-induced anxiety.MethodsA rat model of morphine addiction and withdrawal was made by daily subcutaneous injections of increasing morphine for morphinism and subsequent naloxone injections for rapid withdrawal. Rat anxiety severity was assessed using an elevated cross maze. The effect of electroacupuncture on brain neurotransmitter DA content was observed.ResultsElectroacupuncture significantly increased OE% and OT% values (P＜0.01) and decreased the brain DA content (P＜0.05) in the rats with morphine withdrawal-induced anxiety. ConclusionElectroacupuncture can improve withdrawal symptoms and relieve withdrawal anxiety in morphine withdrawal rats. The mechanism may be related to electroacupuncture regulating the brain DA content in morphine withdrawal rats.

[Key words]Electroacupuncture; Morphine withdrawal; Dopamine; Rat