液相色谱法测定饲料添加剂L-肉碱盐酸盐

2011-04-28上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所赵志辉

中国饲料 2011年13期

上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所林淼赵志辉

左旋肉碱（L-carnitine）具有提高养殖动物的免疫力、抗应激能力，改善肉品质，提高存活率等作用（周键鸿和刘冬生，1996）。它常以盐酸盐的形式存在，即L-肉碱盐酸盐（左旋肉碱盐酸盐）。我国在1999年7月26日，由农业部发布的《允许使用的饲料添加剂品种目录》中，L-肉碱盐酸盐被列入其中。目前国家标准检测方法是采用非水滴定法。以冰乙酸为溶剂，结晶紫为指示剂，高氯酸为标准溶液滴定L-肉碱盐酸盐结构中的碱性氮（饲料添加剂左旋肉碱 NY/T1028-2006）。此方法的优点是方法简便，容易操作，成本较低，然而存在的缺点是无法排除其他含有碱性氮结构的物质（如甜菜碱、氯化胆碱等饲料添加剂）干扰。由于L-肉碱盐酸盐具有紫外吸收基团，在210 nm处有最大吸收峰，同时在酸性流动相中与庚烷磺酸钠能够结合形成疏水性离子对，可经反相色谱分离（赵榕等，2004）。因此本实验中建立反相液相色谱法测定L-肉碱盐酸盐。

1 实验部分

1.1 方法原理饲料添加剂中L-肉碱盐酸盐用二次蒸馏水超声提取。在酸性流动相中与试剂庚烷磺酸钠结合形成疏水性离子对，经反相色谱分离。

1.2 试剂与材料

1.2.1 试剂甲醇：色谱纯；流动相：称取3.4 g磷酸二氢钾溶液（0.05 mol/L）及0.20 g庚烷磺酸钠（0.002 mol/L）溶于500 mL水中，用磷酸调pH=2.5，甲醇（色谱纯）含量为5%。

除特殊说明，所用试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2.2 L-肉碱盐酸盐标准溶液准确称取L-肉碱盐酸盐标准品（Sigma公司提供）0.0200 g，用二次蒸馏水溶解并定容于10.0 mL，此溶液含L-肉碱盐酸盐为2.0 mg/mL。

1.3 仪器与设备 Waters2695高效液相色谱系统：配有2487紫外检测器；超声波提取器；溶剂微孔过滤器带0.22 μm水相滤膜；离心机：10000 r/min。涡旋振荡器。

1.4 实验方法

1.4.1 试样制备试样取20 g左右，混合均匀，粉碎，称取0.1 g（含L-肉碱盐酸盐50～100 mg）于100 mL容量瓶中，加入二次蒸馏水约50 mL，超声提取30 min，用二次蒸馏水定容，混匀，离心，弃初滤液数毫升，收集滤液，过0.22 μm水相滤膜。滤液直接供HPLC分析。

1.4.2 色谱分析色谱条件：ASB VS851505-0；色谱柱：C8柱，4.6 mm × 150 mm；柱温：35 ℃；流动相流速：1 mL/min；检测波长：210 nm；分别取标准溶液及试样10 μL进样。根据保留时间及标准加入法定性，试样峰面积与标准峰面积比较定量。

1.4.3 结果计算 X=Cs×V×W×n/m；W=A/As。

式中，X为试样中L-肉碱盐酸盐含量，mg/g；Cs为标准溶液L-肉碱盐酸盐的浓度，mg/mL；V为试样定容体积，mL；m为试样重量，g；A为试样溶液对应的色谱峰面积响应值；As为标准溶液L-肉碱盐酸盐对应的色谱峰面积响应值；n为稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1 色谱柱选择由于L-肉碱盐酸盐极性较强，普通的C8柱对其保留很弱，即使加入离子对试剂也很难满足分离要求。于是测试了ASB反相色谱柱，由于其耐水性强（可使用100%水为流动相），并且极性很强，对极性化合物具有很强的分离能力，增强了肉碱的保留能力，可满足分析要求。

2.1.2 缓冲体系离子对反相液相色谱要求较严格的pH值范围，对柠檬酸及磷酸盐缓冲体系分别进行了测试，使用柠檬酸缓冲体系时，灵敏度低且出峰时间过早（2.5 min出峰），不宜与溶剂峰分离（两种缓冲体系的叠加色谱图见图1），所以选择磷酸二氢钾-磷酸作为缓冲体系。通过对磷酸二氢钾浓度以及pH值的选择，当磷酸二氢钾浓度为0.05 mol/L、pH值为2.5时，标准品、饲料添加剂L-肉碱盐酸盐均可以得到较稳定的分离测定结果。

2.1.3 有机相分别对乙腈和甲醇进行了测试，使用乙腈出峰时间过早，不易分离。使用甲醇作为有机相时可以得到较好的分离效果。随着甲醇浓度的不断加大，L-肉碱盐酸盐的保留时间不断缩短，在5%甲醇的色谱条件下，出峰时间为4 min左右，不受杂质及试剂的干扰，能够达到实验的要求。

图1 两种缓冲体系的叠加色谱图

2.1.4 离子对试剂在1.0、2.0 mmol/L及3.0 mmol/L浓度下，分别对离子对试剂庚烷磺酸钠的影响进行了实验。结果表明，随着庚烷磺酸钠浓度的加大，肉碱的保留时间增长。但是，离子对试剂对色谱柱损害较大，因此，庚烷磺酸钠的浓度定为2.0 mmol/L。

因此，在0.05 mol/L磷酸二氢钾、2.0 mmol/L庚烷磺酸钠、pH=2.5、5%甲醇的色谱条件下，肉碱出峰时间为4 min左右，不受杂质及试剂的干扰，能够达到实验的要求。

2.2 提取条件的选择酸性条件有利于L-肉碱盐酸盐与庚烷磺酸钠形成稳定的离子对，因此测试了用0.50 mmol/L盐酸和纯水提取试样中L-肉碱盐酸盐。结果发现，用0.50 mmol/L盐酸与用纯水提取效果均较好，但用盐酸提取时溶剂峰很高，不利于观察，而且用纯水提取方法简单，因此本方法选择纯水作为提取液。在上述优化条件下得到了500 μg/g的L-肉碱盐酸盐标准谱图（图2）。

图2 标准溶液谱图

2.3 精密度和准确度实验选取3批不同含量的L-肉碱盐酸盐饲料添加剂，按照本方法确定的条件进行重复实验，每批样品分别制备5份溶液，每个浓度测定3次取平均值，测试L-肉碱含量，得到变异系数分别为0.28%、0.33%和0.25%，结果表明，本方法具有良好的准确度。

2.4 回收率实验采用标准加入法对4种饲料添加剂产品进行了回收率实验（n=3），结果见表1。实验结果表明，在上述优化条件下本实验方法可行。

2.5 方法线性范围及检出限配制一系列不同浓度（25～4000 μg/g）的L-肉碱盐酸盐标准溶液，在上述优化条件下测得峰面积，以峰面积对浓度作图，得到了L-肉碱盐酸盐的工作曲线。以信噪比（S/N=3）对应浓度确定检测下限，得到线性回归方程为y=118.29x-1987.5，相关系数r=0.9999；检出限为 7.5 μg/g。

表1 回收率结果（n=3）

2.6 抗干扰实验甜菜碱和氯化胆碱是两种与L-肉碱盐酸盐类似的含碱性氮结构的饲料添加剂。非水滴定法无法区分这几类物质。为了确定检测到的物质不是同类物质，用本方法的色谱条件对这两种饲料添加剂进行了测试，结果如图3、4所示。甜菜碱保留时间为2.7 min，而氯化胆碱在此条件下无响应，表明这两种物质不会对L-肉碱盐酸盐造成干扰。