王楠,刘 斌*,杨东辉,王 冠,史永锋,张基昌,武军铎,张 涛

（1.吉林大学白求恩第二医院心血管内科,吉林长春 130041;2.吉林省电力医院）

代谢综合征（Metabolic Syndrome,MS）是以中心性肥胖、糖尿病或糖调节受损、高血压、血脂异常以及胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）为共同病理生理基础,以多种代谢性疾病合并出现为临床特点的一组临床症候群。越来越多的研究表明MS是缺血性心脏病的主要危险因素之一。AryaMani[1]于2007年发现在具有早发MS及冠心病特征伊朗一家族中LRP6基因第1973位碱基由C突变为T,引起了半胱氨酸（Cys C）替代了精氨酸（Arg R）,而第1973位碱基组成的密码子对应的氨基酸为第611位氨基酸,当第1973位碱基为C时它所表达的氨基酸为精氨酸（Arg R）,而该为碱基为T时,它所表达的氨基酸为半胱氨酸（Cys C）,即LRP6基因Arg611Cys简称LRP6基因R611C。在此家族中有该基因突变的患者有高血压、高血脂和糖尿病,并且他们有非常高的发生心脏病的风险。该家族一个重要的特征是,有基因突变的成员表现MS和早期冠心病,但无基因突变的成员则是正常的。本研究探讨我国吉林地区汉族MS与LRP6基因R611C基因多态性的有无相关性。

1 实验方法

2008年8月-2010年2月吉林大学第二医院心内科患者均来自吉林省地区汉族人群194例。入院后身高、体重、腰围、血压,并空腹12小时采静脉血由我院化验科生化室检测空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。分为（1）MS组（MS）（n=98）其中MS组包含血糖升高患者（＞5.6 mmol/L）（n1=58）、高血压（BP＞140/90mmHg）患者（n2=66）、高脂血症（n3=62）。（2）对照组（n=96）:其中血糖＜5.6mmol/L（n1=66）、血压正常（n2=68）、血脂正常（n3=65）。

从基因文库中调取的LRP6第1955位至2166位mRNA基因序列全长共211 bp即为PCR目的基因片段（详见下图）（genemap序号:gi|148727287|ref|NM002336.2|Homo sapiens LRP6）,mRNA）

ATAGACCTCAGGGCCTTCGCTGTGCTTGCCCTATTGGCTTTGAACTCATCAGTGACATGAAGACCTGCATTGTCCCAGAGGCTTTCCTTTTGTTTTCACGGAGAGCAGATATCAGACGAATTTCTCTGGAAACAAACAATAATAATGTGGCTATTCCACTCACTGGTGTCAAAGAAGCTTCTGCTTT GGATTTTGATGTGACAGACAACCG应用Primer5.0引物设计软件进行引物设计,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。（注:第1975位、1976位碱基为CT,在不影响PCR产物和酶切位点的情况下,为使CSP45Ⅰ限制性内切酶酶切,在设计上游引物时将第1975位、1976位碱基设计为AA,形成CSP45Ⅰ限制性内切酶的回文序列TT*CGAA）

上游引物:5'-ATAGACCTCAGGGCCTTCGAAGTGCTTGC-3',

下游引物:5'-GGATTTTGATGTGACAGACAACCG-3'

2.2.4 CSP45Ⅰ限制性内切酶酶切位点:（TT*CGAA）

5'… TTCGAA…3',

3'… AAGC TT…5'

2 数据处理

所有数据应用SPSS15.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数士标准差（±s）表示,计数资料以百分数表示,基因型和等位基因频率采用基因计数法计算单个基因型,组间等位基因频率比较采用四格表χ2检验和R×C列联表 χ2检验,P＜0.05为有显著性差异;通过病例对照研究,运用logistic回归分析的方法,验证各组基因型和对照组基因型之间的关系计算出比值比（odds ratio,OR）及95%可信区限（confidence intervals,CI）,以OR的95%CI不包含1为具有显著性差异。

3 结果

3.1 MS组和对照组临床资料及生化指标比较

MS组和对照组在年龄上无统计学差异（P＞0.05）,MS组与对照组在体重指数（BMI）、腰围、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）上均有显著统计学差异（P＜0.05）。

3.2 所得PCR产物分别用限制性内切酶CSP45I进行特定序列的酶切有三种电泳结果见图1中2、3、4道。

3.2.1 当第1973位碱基C突变为T时则酶切后电泳应出现一条211 bp电泳条带,此时基因型为CC型（图1中2道）。

3.2.2 当第1973位碱基C不发生突变为T时则酶切后电泳应出现两条条带即194 bp与17 bp,由于17 bp的电泳带与194 bp差距较大且Marker最小为200 bp,故17 bp电泳条带观察不到,只观察到一条194 bp条带,此时基因型为纯合子RR型（图1中3道）。

表1 两组临床资料及生化指标检测结果

图1 PCR扩增及CSP45I酶切后电泳图

3.2.3 若酶切后电泳出现两条条带分别为211 bp与194 bp,17 bp电泳条带观察不到,211 bp条及194 bp条带均较暗,则此时基因型为杂合子RC型（图1中4道）。

3.3 各组LRP6基因R611C基因频率表

表2 MS组和对照组LRP 6基因R 6 1 1 C基因频率表

表3 血糖升高患者与血糖正常患者LRP6基因R611C基因频率表

表4 高血压患者与血压正常患者LRP6基因R611C基因频率表

表5 肥胖组和对照组LRP6基因R611C基因频率表

表2、表3、表4、表5结果分析表明LRP6基因 R611C 基因多态性与MS、血糖升高、血压升高、肥胖均无相关性。

表6 高脂血症患者与血脂正常患者LRP6基因R611C基因频率表

4 讨论

代谢综合征是一组由遗传因素与环境因素共同决定的临床症候群,包括葡萄糖与胰岛素代谢异常、肥胖（特别是腹型肥胖）、高脂血症与高血压。低密度脂蛋白受体相关蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein6,LRP6）是 1998年被克隆出来的单跨膜受体[2,3],是LRP家族成员之一,LRP6基因近年来成为研究热点之一,LRP6基因在人和小鼠之间具有极高的同源性,并且在果蝇中也存在对应的同源基因:Arrow[4,5]。人的LRP6基因在染色体上的位置为12p11-p13,mRNA为9 kb,相对应的蛋白质为 1613个氨基酸,具有信号肽和跨膜区,是I型单跨膜蛋白质。Arya Mani[1]于2007年发现在具有早发MS及冠心病特征伊朗一家族中LRP6基因第1973位碱基由C突变为T,引起了半胱氨酸（Cys C）替代了精氨酸（Arg R）。伊朗及美国大样本MS人群研究并没有发现这一基因突变。2008年日本学者Yukio[6]在对日本2型糖尿病患者研究中亦未发现与LRP6基因R611C基因多态性有相关性。本研究结果表明LRP6基因R611C与吉林汉族地区MS的发生无相关性,考虑LRP6基因R611C与MS相关可能只存在特殊遗传家族中,也可能是LRP6基因R611C与MS的某一表型如血糖升高、高血脂、高血压、肥胖等有关。有研究表明在小鼠中TCF7L2基因（也称TCF4）是调节胰高血糖素样肽-1分泌,与β-catenin共同作为 Wnt信号的转导因子[7]。LRP6、TCF7L2的过度表达可以标记的肥胖鼠模型中增加高胰岛素血症和胰岛素抵抗从而使胰岛素的敏感性增加和脂肪细胞的减少,并最终导致血糖稳定的提升。但本研究结果未发现LRP6基因R611C与血糖升高相关。LRP6参与清除细胞内TG含脂蛋白进程,LRP6所在12p13区域包括TNFRSF和TNFRSF7基因,TNF受体家族成员明显影响脂代谢和心血管的整体性。肿瘤坏死因子α（TNFα）和其他炎症细胞因子的分泌被视为一个重要的肥胖相关的因素从而导致MS[8]。但LRP6是否与肥胖有关仍无确切研究。

目前LRP6基因R611C是否能引起高血压及具体机制尚未报道,本研究发现与吉林汉族地区患者高血压无相关性。SheidaMani等[9,10]2008年在小鼠上发现 LRP6基因 R611C控制的表皮生长因子受体（EGFP）突变同高胆固醇血症和早发的动脉粥样硬化相关,但它引起疾病的机制尚不清楚。SheidaMani等人推测LRP6基因R611C作用机制为LRP6突变受体在酸性环境中增加突变受体的亲和力而导致在较晚的内吞体中LDL出现损伤分离,而这些内吞体能协调LDL与浆细胞膜之间循环,从而减低了对LDL清除作用,可引起引起MS的一个表型高脂血症、高胆固醇血症。研究表明LRP6基因R611C在小鼠实验中可引起高脂血症,本研究亦证实了LRP6基因R611C基因多态性与吉林地区汉族MS组中高脂血症的发生具有相关性。目前关于LRP6基因R611C基因多态性的研究有一定的进展,但是LRP6基因R611C在MS病理生理中的确切机制及地位还需进一步证实。随着其作用机制日益明确和研究深入,该基因有望成为MS治疗的新的靶位点。

[1]Mani,A.Radhakrishnan,J.Wang,H.Mani,A.Mani,M.A,et al:LRP6 mutation in afamily with early coronary disease andmetabolic risk factors[J].Science,2007,315:1278.

[2]WehrliM,DouganST,CaldwellK,O KeefeL,SchwartzS,Vaizel OhayonD,Schej-terE,Tom linsonA,DiNardoS.Arrow encodesan LDL2 receptor2 related proteine ssen-tial for W ingless signalling[J].Nature,2000,407（6803）:527.

[3]Hey P J,TwellsRC,PhillipsM S,etal.Cloning of a novelmember of the

lowde-nsity lipoprotein receptor family[J].Gene,1998,216（1）:103.

[4]Brown SD,Twells RC,Hey P J,et al.Isolation and characterization of LRP6,anovelmember of the low density lipoprotein receptor gene fam ily[J].Biochem BiophysResCommun,1998,248（3）:879.

[5]WehrliM,Dougan S T,Caldwell K,et al.arrow encodesan LDL-receptorrelatedprotein essential for W ingless signalling[J].Nature,2000,407（6803）:527.

[6]Yukio Horikawa etal.Lack of Association of LRP5 and LRP6 Polymorphismwith Type 2 DiabetesMellitus in the Janpanese Population[J].Endocrine Journal2008:55（4）:699.

[7]Stavros C.Manolagas and Maria Almeida Gonewith theWnts:Catenin,T

CellFactor,Forkhead BoxO,and Oxidative Stress in Age-Dependent Dis-easesof Bone,Lipid,and GlucoseMetabolism[J].Molecular Endocrinology,2008,21（11）:2605.

[8]Gabriele E.Sonnenberg,et al.Genetic Determ inants of Obesity Related LipidTraits[J].Journal of Lipid Research,2007,22（11）:1126.

[9]Wenzhong Liu;MojganGharipour,etal.Lrp6Mediates Cellular Cholesterol Upta-ke[J].Circulation,2007,116:183.

[10]Wenzhong Liu,SheidaManiMutation in EGFPDomain of LDL Receptor Related Protein 6 Impairs Cellular LDL Clearance[J].Circulation Research,2008,103:1280.