栗景蕊，贺争鸣

（中国药品生物制品检定所，北京 100050）

免疫荧光技术在病毒领域应用最为广泛，并且取得很大成就，主要用于病毒抗原在器官细胞内的定位，病毒感染过程的研究，也可用来检查血清中的抗病毒抗体［1］。猴群中猴泡沫病毒的自然感染率较高，检测血清中抗体可以作为有效的筛查方法。由于间接免疫荧光法测定血清中抗体特异性和稳定性较好，通过浓度梯度滴定，分别确定了一抗猴血清和二抗FITC标记的羊抗人IgG抗体的最佳工作浓度，建立了针对猴血清的间接免疫荧光方法（IFA）来检测SFV，为保证猴源性生物材料使用的安全性打下了基础。

用SFV病毒BHK-21细胞培养的方法制备抗原，通过浓度梯度滴定，分别确定了一抗猴血清的最佳工作浓度和二抗FITC标记的羊抗人IgG抗体的最佳工作浓度。建立针对猴血清的间接免疫荧光方法（IFA），从而用以检测实验用猴群中SFV的感染情况，根据荧光强度可以对猴血清抗体水平进行半定量分析。

1 材料和方法

SFV-1株，购自 ATCC，编号：VR-276。培养细胞为幼仓鼠肾传代细胞（BHK-21），中国药品生物制品检定所实验动物质量检测室保存。

1.20.01 mol/L、pH 7.2的 PBS

1.3 FITC标记的羊抗人 IgG抗体：KPL公司产品，实验中用1％伊文思兰稀释。

1.4 1％伊文思兰：实验中用 0.01 mol/L、pH 7.2PBS作1∶10000稀释。

1.5 猴血清标本：采自国内几个实验用恒河猴生产厂家。

1.6 猴SFVIgG抗体阳性血清、阴性血清：为2008

年采集的血清标本，并用ELISA方法鉴定。

导流洞封堵设计符合规范要求，封堵体布置合理，堵头型式合适，堵头长度满足稳定要求。堵头混凝土材料和灌浆设计合理，指标合适。导流洞封堵方案合理，满足工程蓄水要求。

1.7 SFV的细胞培养

将BHK-21细胞传代培养，在传代24 h之内形成50～70％单层时接种SFV毒种1 m L。置37℃的CO2培养箱内吸附3 h，加入细胞维持液3 m L，置37℃的CO2培养箱继续培养，每日观察细胞病变效应。

1.8 制备抗原片

待接种 SFV病毒的 BHK-21细胞病变达到50％时，弃细胞液，用 PBS洗涤细胞表面一次，弃PBS。胰酶消化后，用PBS将细胞轻轻吹打下来，收集于离心管内。1000 rpm离心10 m in，弃上清，以适量PBS重悬细胞液。将重悬的细胞液滴于抗原片玻片孔中，使细胞铺层面积达到50～80％。室温晾干，至冷丙酮中于4℃固定15 m in，取出于蒸馏水中漂洗一遍，室温晾干。同法设立正常BHK-21细胞对照。

1.9 SFV的间接免疫荧光染色

取细胞抗原片以PBS漂洗一次，室温晾干。滴加用PBS梯度（1∶10，1∶20，1∶40）稀释的血清样品，置湿盒中，37℃保温30 min。用 PBS漂洗三次，5 min/次，室温晾干。滴加以1％伊文思兰梯度（1∶100，1∶250，1∶500）稀释的 FITC标记的羊抗人 IgG抗体，37℃保温30 min。用 PBS漂洗三次，5 min/次，室温晾干。用50％的甘油封片，荧光显微镜下观察结果，并确定一抗和二抗的最佳工作浓度。判断标准，“—”无或可见微弱荧光；“+”可见的荧光；“++”可见有明亮的荧光；“+++”可见耀眼的荧光。

1.10 特异性检测

用猴泡沫病毒抗原片、小鼠白血病病毒抗原片以及正常细胞片与最佳稀释浓度的SFV抗体阳性血清进行间接免疫荧光实验，以验证该检测方法的特异性。

1.11 SFV抗体间接免疫荧光检测方法的初步应用

应用所建立的间接免疫荧光方法对采集的猴血清进行检测。荧光显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 一抗（血清）及二抗（FITC标记的羊抗人IgG抗体）最佳稀释浓度的确定

由实验结果可得：当荧光抗体作1∶100稀释时，特异性荧光最强，非特异性荧光最弱。1∶10，1∶20，1∶40稀释的一抗均可见特异性荧光，其中1∶10可见阳性细胞中清晰的荧光颗粒，荧光效果最好，所以，通过浓度梯度滴定，分别确定了一抗猴血清的最佳工作浓度为1∶10，二抗FITC标记的羊抗人IgG抗体的最佳工作浓度为1∶100。IFA检测方法抗体工作浓度滴定结果见表1。

表1 IFA检测方法抗体工作浓度Tab.1 The concentration of antibody in IFA detection method

2.2 特异性检测结果

用猴泡沫病毒抗原片、小鼠白血病病毒抗原片以及正常细胞片与最佳稀释浓度血清进行 IFA实验，猴泡沫病毒抗原片为阳性，小鼠白血病病毒抗原片及正常细胞片均为阴性。这一结果表明，制备SFV抗原片用间接免疫荧光法检测猴血清中 SFV IgG抗体特异性较好，检测结果较可靠。

2.3 应用所建立的间接免疫荧光方法对采集的猴血清进行检测

荧光显微镜下观察结果。见彩插4图1，BHK-21细胞对照无荧光出现，也未观察到荧光背景干扰。阳性血清的IFA检测可见绿色荧光，且细胞形态完整。在阳性血清（3）图中可见形成合胞体细胞，与SFV的致细胞病变效应一致，SFV感染机体组织，可使细胞圆缩、脱落并伴合胞体形成。阴性血清的IFA检测结果为红色细胞，未见绿色荧光，为典型的IFA检测阴性表现。34份猴血清检测结果为：SFV抗体阳性19例，阴性15例，与猴泡沫病毒在猴群中较高的感染率一致。同时说明所建立的猴泡沫病毒抗体的间接免疫荧光检测方法效果较好。

3 讨论

猴泡沫病毒是灵长类动物特有的病毒，在猴群中自然感染率可达70％［2］，这些灵长类动物携带有SFV，但不会因感染而发病。SFV已经成为生物医学实验研究中常见的有干扰作用的病原体，已有报告证明我国猴群中SFV检出率11.36％［3］，抗体阳性率88.12％［3］。猴作为一种重要的模式动物，应用于多种疾病模型，也用于相关生物制品的生产，因此，进一步完善对实验猴群的质量监控迫在眉睫。在实验动物病毒检测等级标准中，猴泡沫病毒是清洁级实验动物应排除的病原体。随着对 SFV研究的不断深入，探索敏感性更高、特异性更好的检测方法，对于保证实验猴群的质量，控制SFV传播和人民用药安全具有深远意义。

猴泡沫病毒间接免疫荧光检测方法是以猴血清中的IgG抗体为检测对象，准确度较好，特异性高，稳定性好，非特异性荧光染色少。免疫荧光检测方法与猴泡沫病毒的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、全病毒ELISA法和RT-nestPCR相比，不仅取样便捷，检测效率也得到了大幅提高。应用所建立的间接免疫荧光方法检测SFV抗体时，取制备好的抗原片，每孔可检测一份血清样本，可以对实验用猴的血样进行批量检测。该检测方法可用于对实验猴养殖单位进行定期检查，有利于保证实验用猴质量，确保疫苗生产用生物材料的安全性。该检测方法操作程序简单易用，并可进一步制成检测试剂盒，操作程序化，适合大面积推广和应用。

SFV的血清学检测方法中，有报道分别用两种不同的 SFV 抗原：SFV（AGM）（african green monkey）和 SFV（CPZ）（chimpanzee）来评价动物体内SFV感染。这种方法程序复杂，且仅适合于极少数量非人灵长类动物的检测。为使 SFV的血清学检测更为便捷，Hussain［4］等人将来源于SFV（AGM）和SFV（CPZ）的抗原相结合再进行 CA-WB（CPZAGM Westren blot）检测，与PCR检测结果一致。利用CA-WB还在曾经认为未受SFV感染的沼泽猴、长臂猿等体内检测到SFV，说明CA-WB具有较高的敏感性。国外还报道了一些检测SFV的特殊技术，包括逆转录酶的测定、透射电子显微术、免疫印迹法以及高敏感性的 PCR方法［5］。猴泡沫病毒在动物体内常呈隐性感染，在分析动物SFV感染状况和检测生物制品 SFV污染时，为了提高检测的准确性，防止漏检错检，适当的联合运用各种检测方法对SFV的综合评估非常重要。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版第三部，中国医药科技出版社.

［2］高一彤，曲京华，赵玫，等.灵长类泡沫病毒的调查研究及现状［J］.医学动物防制，2006，22（3）：183-184.

［3］张永江.干扰生物医学实验研究的动物疾病［J］.畜牧兽医科技信息，2006，1（1）：60-62.

［4］Hussain AI，Shanmugam V，Bhullar VB，etal.Screening for simian foamy virus infection by using a combined antigen Western blot assay：evidence for a wide distribution among Old World primates and identification of four new divergent viruses［J］.Virology，2003，309（2）：248-257.

［5］Khan AS，Sears JF，Muller J，etal.Sensitive assays for isolation and detection of simian foamy retroviruses［J］.JClin Microbiol，1999，37（8）：2678-2686.