刘 石，哈斯通拉嘎，王瑞宁，郭东辉，胡清林，魏战勇

(1.河南农业职业学院，河南 郑州 451450;2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002;3.郑州牧业工程高等专科学校，河南郑州 450002)

PPV感染Marc-145细胞后对其分泌IL-13转录时相的影响

刘 石1，2，哈斯通拉嘎3，王瑞宁2，郭东辉2，胡清林2，魏战勇2

(1.河南农业职业学院，河南 郑州 451450;2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002;3.郑州牧业工程高等专科学校，河南郑州 450002)

运用荧光定量PCR技术，测定和分析猪细小病毒 (PPV)感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-13的分泌水平。结果IL-13的表达量在1，3和24 h明显增加，48 h轻微下调。

Marc-145细胞;白细胞介素13;猪细小病毒;转录时相

猪细小病毒 (Porcine parvovirus，PPV)是引起妊娠母猪繁殖障碍的主要病原体之一。初产妊娠母猪感染后，经胎盘侵袭胚胎或胎儿，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形及木乃伊化，致使母猪不孕或反复发情，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻［1］。猪细小病毒在猪群中检出率甚高，在猪群中的血清抗体阳性率达50%～80%，给养猪业带来巨大的经济损失［2］。炎性细胞因子特别是白细胞介素具有介导天然免疫、调节淋巴细胞活化、生长和分化等免疫调节作用，是目前临床医学、免疫学和肿瘤学等领域的研究热点之一［3］。体内白细胞介素的表达发生异常，与机体免疫功能低下或发生病理损伤有关［4］。对炎性细胞因子特别是白细胞介素表达量的准确测定，反应机体的免疫状态、揭示疾病的发病机理、探索感染后机体的免疫应答规律均具有重要意义。常用的检测白细胞介素等细胞因子的方法 (放射免疫法、ELISA、MTT法)不同程度上存在灵敏度不高、污染环境、费时、操作复杂和难以准确定量等缺点，对操作者和环境造成毒害的问题。实时荧光定量PCR技术以其准确、快速、定量的优点，迅速被应用于功能基因组、分子医学、病毒学、微生物学及生物工艺学等领域［5］，也是测定在细胞因子的表达研究方面主要手段之一。我们利用SYBR Green I实时定量PCR检测方法，分不同时间点定量检测PPV感染Marc-145后IL-13 mRNA的表达水平，以便为研究IL-13的抗细小病毒机制提供理论参考和试验依据，并为预防控制PPV提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

猪细小病毒7909标准毒株 (PPV-7909)购自中国兽药监察所，病毒滴度为106.1TCID50·mL－1。

1.1.2 细胞

Marc-145细胞为本实验室保存，细胞生长于含10%新生犊牛血清的DMEM培养基中，5%CO237℃培养。

1.1.3 主要试剂

Protein K(Promega公司);RPMI-1640培养基(GIBCOBR公司);Trypsin(Invitrogen);胎牛血清 (Hyclone公司);E.Z.N.A Total RNA KitⅠ(OMEGA);SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas);其他常规试剂均为分析纯。

1.1.4 主要仪器

Mastercycle ep realplex Real-Time PCR 仪(Eppendorf公司);台式高速低温离心机 (德国Sigma公司);PTC-200型PCR仪 (M J Research公司);紫外凝胶成像系统 (美国SIM公司);小型台式离心机 (德国Sigma公司)。

1.2 病毒感染

将Marc-145细胞用胰酶溶液分散后，培养于6孔培养板 (2×105个·孔－1)，培养细胞丰度达80%后，用PBS洗2次，将PPV接种于Marc-145，吸附60 min，期间每隔15 min轻轻晃动1次，洗去未吸附的病毒，添加含有2%胎牛血清的DMEM维持液。

1.3 细胞的收集

将病毒感染后1，3，24和48 h的细胞分别用PBS洗2次，添加0.25%胰酶消化细胞，1 000 g离心10 min收集 Marc-145细胞，保存于 －80℃备用。

1.4 DNA及RNA的提取和反转录

按蛋白酶K法提取病毒DNA，参照E.Z.N.A Total RNA KitⅠ说明书提取细胞总RNA，具体方法和步骤参照文献进行［6］，以提取的总 RNA为模板进行反转录，反转录合成的cDNA及提取的DNA作为荧光定量PCR模板。

1.5 引物和相对定量PCR

引物的设计使用Primer Premier 5.0软件，参照GenBank公布序列进行。基因名称、参考序列、退火温度及产物大小见表1。荧光定量PCR反应体系为 20 μL，其中 SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 600 ng。反应条件为95℃ 1 min;95℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，共进行40个循环，循环结束升温至95℃ 15 s，再降至60℃ 15 s，开始从60℃递增至95℃ 20 min，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15 s结束反应。

表1 Real-time PCR引物及其反应条件

1.6 数据处理

在实时定量PCR中，Ct值是反映模板中目标基因含量的一个重要指标，通过样品和标准曲线Ct值比较，可以准确计算出RNA含量。另外，将目标基因与持家基因β-actin比较，消除由于收集细胞、反转录和加样中操作误差。将0 h未接种病毒的细胞因子的表达量设为1×，使用Mastercycle ep realplex Real-Time PCR软件分析各基因相对于0 h的表达量变化水平。

2 结果和分析

2.1 病毒DNA水平测定

Marc-145单层细胞感染 PPV后，在1，3，24和48 h分别收集细胞，提取DNA，做荧光定量PCR，与β-actin进行比较分析，并将病毒感染1 h时病毒DNA含量定义为1×，得出不同时间病毒DNA在细胞的增殖倍数，结果见图1。

图1 PPV在Marc-145细胞中增殖规律

由图1可知，病毒感染后1 h就可以检测到病毒DNA，但病毒量相对较低;随后开始逐步上升，在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖，48 h达到最高峰，从感染后24 h的13倍增殖到170倍左右。

2.2 细胞因子的测定

Marc-145单层细胞在感染PPV后1，3，24和48 h分别收集细胞，提取 RNA，反转录获得cDNA，做荧光定量PCR，并与β-actin进行比较分析，并以病毒感染0 h时mRNA含量定义为1×，得出不同时间细胞因子RNA在细胞的增殖倍数，结果见图2。

图2 白细胞介素IL-13的转录时相

由图2可知，IL-13的表达量在1，3和24 h明显增加，48 h轻微下降低于细胞对照水平。

3 小结和讨论

实时荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新技术，它是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析［7］。该技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性等特点［8］。目前在不同的研究领域得到广泛的应用。

PPV可以在ST、PK-15、Marc-145等多种细胞中增殖并引起细胞病变。本研究发现在PPV感染Marc-145细胞后1 h能检测到病毒，24 h后开始大量增殖，在感染后48 h达最高峰，达到170倍左右，这可能是由于病毒大量增殖，释放所致。

白细胞介素 (IL)主要是由淋巴细胞产生的一类细胞因子，在传递信息、激活和调节免疫及在炎症反应中起重要作用。自20世纪70年代发现IL以来，已经有33种IL相继被发现。白细胞介素13(IL-13)是由活化的T细胞分泌的一种多效应细胞因子，在不同的细胞类型如单核细胞、B细胞、肥大细胞和角质形成细胞中功能不同。它能诱导B细胞增殖和分化，促进IgE合成，促进内皮细胞上表达某些粘附分子及抑制HIV-1病毒复制，并对某些癌细胞具有高度毒性［9－10］。具有免疫抑制和免疫调节作用，在机体免疫应答中可抑制单核、巨噬细胞产生的炎性细胞因子而具有显著的抗炎能力，并能促进B细胞增殖和抗体的分泌［11］，在过敏性炎症反应过程中起重要的作用［12］。IL-13能抑制IL-12产生，但能诱导Th1类细胞因子IL-2和IFN-γ 的产生［13］。

本试验研究表明，PPV感染Marc-145细胞后IL-13的表达量在1，3和24 h明显增加，48 h轻微下降低于细胞对照水平。Briere等［14］研究表明，IL-13不能抑制病毒进入细胞的过程，但能明显抑制病毒蛋白和逆转录酶的产生，降低病毒的细胞致病性。我们推测在PPV感染 PK-15细胞后促炎细胞因子的表达先于抗炎细胞因子，在1 h时启动抗炎细胞因子IL-13作为自我防御机制参与细胞免疫过程，细胞中IL-13 mRNA的表达水平可作为观察病情活动状态的一个免疫学指标。

本试验利用荧光定量PCR测定和分析PPV感染Marc-145细胞后细胞因子mRNA表达量的变化，PPV感染后可引起Marc-145细胞分泌IL-13，且感染后1，3和24 h明显增加。这为以后PPV分子致病机制，评价疫苗的细胞免疫效果和药物抗病毒的药效机制提供了试验基础和依据。

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S 852.4

A

0528-9017(2011)03-0710-03

文献著录格式:刘石，哈斯通拉嘎，王瑞宁，等.PPV感染Marc-145细胞后对其分泌IL-13转录时相的影响 ［J］.浙江农业科学，2011(3):710－713.

2011-03-08

河南省重点科技攻关项目 (08210213007)

刘 石 (1984－)，男，河南郑州人，学士，主要从事分子免疫学和分子病毒学研究工作。E-mail:hnls60@126.com。

注:胡清林系通信作者。

(责任编辑:吴益伟)