戴 冰， 肖子曾， 冷 旺， 梅 君

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007;2.湖南中医药大学，湖南长沙410208)

在真核生物中，外部信号从细胞膜到细胞核影响基因的转录变化涉及许多信号通路，环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信号途径是其中的范例之一。有研究表明，六味地黄汤能改善和调节阴虚型小鼠血浆cAMP系统［1］，而目前研究六味地黄方对cAMP的作用主要停留在血液中cAMP的阶段，为了进一步阐明该方对细胞内cAMP的作用，我们选用了大鼠前脂肪细胞作为研究对象，来探讨六味地黄丸的药理作用与cAMP的关系;同时有研究发现肾上腺素可明显升高RPE细胞内cAMP水平，其作用机制是通过结合RPE细胞膜上β-AR，使细胞内cAMP浓度增加［2］。因此我们选用肾上腺素作用大鼠前脂肪细胞，旨在探讨六味地黄丸对细胞内cAMP水平的影响及其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物与药物 健康SD大鼠，清洁级，♀♂各半，体重(200±20)g，由长沙市开福区东来创实验动物科技服务中心提供，许可证号:SCXK(湘)2006-0001。六味地黄丸(浓缩丸)，由湖南省长沙九芝堂制药有限公司生产，批号为060361。

1.2 试剂与仪器 肾上腺素(批号:20060514)，pH7.2缓冲生理盐水(自制)，含酚红 DMEM低糖培养基(批号123K83031)购自 Sigma公司，标准胎牛血清(批号20050617)购自兰州民海生物有限公司，胰酶购自sigma公司，cAMP试剂盒购自上海中医药大学同位素室，其余试剂均为分析纯;3K30型高速冷冻离心机(sigma公司产品)，UV-1600紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司产品)，佳能照相系统，XDS-1B体式倒置相差显微镜(日本Olympus)，Heracell型细胞培养箱(德国贺利氏产品)，超净工作台(北京半导体设备一厂)，台式离心机(北京医用离心机厂)，恒温水浴箱(北京半导体设备一厂)。

2 实验方法

2.1 六味地黄丸药液的制备 取六味地黄丸120丸加纯净水约300 mL，搅拌，超声使之完全溶解后，添加纯净水至375 mL，使其药液浓缩至2.0 g/mL，供实验用。

2.2 含药血清的制备 取SD大鼠20只，随机分为2组，每组10只，♀♂各半，禁食不禁水12 h，第1组以六味地黄丸30 g/kg的剂量灌胃给药，每天3次，连续3 d，于第3天最后一次给药后1 h，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经肝门静脉取血5 mL，第2组作为空白对照组灌以等量的水，操作同上，所有两个组取血后静置4 h，1 500 r/min离心30 min，取上清液，分装，-20℃冷冻保存。实验前将第1组含药血清以增殖培养液配成终浓度分别为5%、10%、20%的培养液，即低、中、高不同剂量组。(终浓度=加入的血清体积/总体积×100%)。

2.3 大鼠前脂肪细胞的培养 取雄性大鼠腹股沟部纯净脂肪颗粒，pH 7.2缓冲生理盐水(PBS)洗涤后剪成0.5～1 mm3大小均匀的小颗粒，以1 000 r/min离心10 min取上层的纯脂肪颗粒，轻轻地铺于经培养液润湿的培养瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培养液5～10 mL，塞紧瓶塞，将底面翻转朝上。37℃、5%CO2培养1～2 h，待黏附牢固后，翻转培养瓶做正常培养每日观察。原代培养区域性单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代，取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。

2.4 分组、给药 取传代7代以内的细胞分为空白大鼠血清组(简称空白组)、肾上腺素+空白大鼠血清组(简称肾上腺素组)、六味地黄丸含药血清高剂量组(简称丸高组)、六味地黄丸含药血清中剂量组(简称丸中组)，六味地黄丸含药血清低剂量组(简称丸低组)、六味地黄丸含药血清+肾上腺素组(简称含肾药物组)，空白组和六味地黄丸高、中、低组分别加入2.2项所制备的相对应的含药血清培养液，含肾空白组以及含肾药物组先分别加入10 nmol/L的肾上腺素血清培养液，培养24 h后换2.2项所制备的相对应的含药血清培养液。六味地黄丸含药血清于细胞传代后立即给予，待培养区域性单层汇合达到约1/2瓶底面积后加入肾上腺素。

2.5 细胞内cAMP水平的检测 取第六代大鼠前脂肪细胞以2×105个/mL的浓度传于50 mL培养瓶中，置37℃、5%CO2培养至生长旺盛时，弃培养液，给药后培养48 h，收集细胞，用pH4.75的醋酸缓冲液悬浮，调整浓度至106个/mL，取1 mL细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，使细胞沉淀，弃去上清液，细胞沉淀加1 mL pH4.75的醋酸缓冲液混悬，反复冻融3～4次，3 000 r/min离心15 min。取上清液100 μL按所购“cAMP测定放射免疫分析试剂盒”使用说明书进行测定。利用cAMP与125I-cAMP和特异性蛋白激酶竞争结合原理测定细胞内cAMP的浓度，GC-1200 r放射免疫计数器上测定放射性强度，从标准曲线上得出细胞内cAMP含量。将实验数据进行成组t检验，统计学处理。

3 结果

六味地黄丸对肾上腺素诱导大鼠前脂肪细胞内cAMP的影响，结果见表1

表1 对肾上腺素诱导大鼠前脂肪细胞内cAMP的影响

表1所示:肾上腺素组与空白组比较，有显著性差异(P＜0.01)，提示肾上腺素能明显使大鼠前脂肪细胞内cAMP含量升高;丸剂各剂量组与空白组比较，六味地黄丸中剂量组和高剂量组有显著性差异，提示丸剂中剂量和高剂量含药血清均能使大鼠前脂肪细胞内cAMP水平降低，低剂量对大鼠前脂肪细胞内cAMP水平没有影响;含肾药物组与肾上腺素组比较，有显著性差异(P＜0.01)，提示六味地黄丸能降低肾上腺素使细胞内cAMP水平升高的作用。同时，含肾药物组与空白组比较，没有显著性差异，进一步说明在肾上腺素使细胞内cAMP水平升高后，六味地黄丸含药血清能使细胞内cAMP含量恢复到正常水平。

总之，本实验研究发现，六味地黄丸含药血清各浓度对大鼠前脂肪细胞内cAMP水平均有降低的作用;六味地黄丸能拮抗肾上腺素升高大鼠前脂肪细胞内的cAMP水平的作用，并使其cAMP含量恢复到正常水平。由于肾上腺素对细胞内cAMP的作用是通过激动细胞膜表面β受体途径达到的，因此，六味地黄丸对细胞内cAMP的影响也可能是由于阻断细胞膜表面β受体途径而产生的。

4 讨论

原代脂肪细胞培养(primary fat cell culture)是指用胶原酶消化，将得到的脂肪细胞作体外培养［3］。目前国内外前脂肪细胞体外培养系统大致有两类，一类来源于血管基质组份细胞(stromal vascular fraction，SVF)，这是经典的前脂肪细胞。此外，近年还有人报道采用脂肪组织块贴壁和天花板培养相结合的方法并获得了成功［4］。在本实验中，我们采用脂肪组织块贴壁和天花板培养相结合的方法对大鼠皮下脂肪的前脂肪细胞进行原代培养，成功培养出了大鼠前脂肪细胞，并且生长良好。

离体培养细胞是从细胞水平研究药物机制较为理想的体外模型。同时由于中药多属粗制剂，如果直接加入细胞培养体系，其中的杂质、电解质及酸碱度等都会对细胞产生影响，从而干扰实验结果。本实验应用血清药理学方法可在某种程度上克服上述干扰，不仅反映药物可吸收部分的直接作用，通过对照，也可反映药物在机体作用下形成的代谢物诱生的机体内源性物质的影响，且更接近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程。

cAMP是人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由三磷酸腺苷(ATP)在腺苷环化酶(AC)催化下生成。细胞内 cAMP增多，能激活 cAMP依赖性蛋白激酶 A(APK)，使细胞内许多蛋白酶磷酸化而使之活化，从而调节代谢，产生生理效应［5］。不少实验资料也表明，当cAMP发生含量变化时，细胞的功能也随之发生明显变化［6］。随着细胞信号传导系统研究的深入，通过调控细胞信号传导系统来研究六味地黄方已倍受关注。

六味地黄方乃滋阴补肾之名方，同时该方还具有抗癌、增强细胞免疫性、调节血压、血脂等方面的作用［7-8］。近年来对该方的研究比较多，也研究的比较深刻，目前研究六味地黄方对cAMP信使的报道不多，而且大部分基于阴虚血液中cAMP含量的研究，有人报道［4］了对氢考I型法复制肾阴虚小鼠服用六味地黄冲剂，显示小鼠血浆中的cAMP含量较未服药肾阴虚组小鼠明显降低。目前研究该方对细胞内cAMP含量的报道甚少，而cAMP信使系统是细胞内一个重要的信息传导通路，具有多种生理及病理作用，在调节免疫反应、细胞增殖分化，维持平滑肌舒缩平衡和血管内环境稳定，参与神经活动，调控基因表达等方面居重要地位［9］。随着研究的深入，其在临床治疗学中的意义也日益凸显。本实验研究发现六味地黄丸能明显降低大鼠前脂肪细胞内cAMP的含量，而六味地黄方自古被认为是滋阴的良方，所以研究六味地黄丸滋阴作用是否是通过改变细胞内cAMP的含量而达到的，甚至该方的其他药理作用是否与细胞内cAMP水平及其信号传导途径有关，对我们进一步加深对该方药理作用本质的认识产生积极作用。

肾上腺素是肾上腺髓质的主要神经递质，它是α、β受体激动药，它能通过激动β受体，激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP水平升高。实验发现六味地黄丸具有降低大鼠前脂肪细胞内cAMP水平的作用。本实验结果表明，当肾上腺素与六味地黄丸联合使用时，细胞内cAMP水平与正常时相比较没有显著差异，表明六味地黄丸能拮抗肾上腺素降低细胞内cAMP水平的作用，而肾上腺素本身能通过激动β受体使细胞内cAMP水平升高，六味地黄丸对肾上腺素的拮抗作用究竟是否完全是通过阻断细胞膜上β受体来达到的，仍需更深入的研究。

［1］肖子曾，戴 冰，黄开颜，等.六味地黄汤对小鼠血浆中环核苷酸的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2004，10(1):44-46.

［2］孙京华，王净信，刘常明，等.肾上腺素对视网膜色素上皮细胞ATP酶活性及细胞内cAMP和钙离子浓度的影响［J］.华中科技大学学报，2006，35(3):392-395.

［3］夏 蓉，杨耀琴，杨虎川.脂肪细胞和前脂肪细胞培养的研究进展［J］.同济大学学报，2003，24(3):249-251.

［4］朱晓海，何清濂，林子豪.人前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立［J］.中华整型烧伤外科杂志，1999，15(3):199-201.

［5］夏宗勤，朱 玟，胡雅儿，等.中医“虚证”理论的初步探讨［J］.中医杂志，1979，11(2):2-10.

［6］迟素敏，李承新，刘亚莉，等.ACh对人垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C、胞内游离钙及cAMP/cGMP的影响［J］.生理学报，2003，55(2):165-170.

［7］宗丽丽，张 瑜，张大禄.六味地黄方的免疫、抗肿瘤药理研究［J］.中成药，2001，23(12):910-913.

［8］徐 速，梅春燕.六味地黄方实验研究进展［J］.时珍国医国药，2003，14(5):312-313.

［9］陈 敏，余江平，黄 敏.环核苷酸的生理作用及临床应用［J］.中国药房，2007，18(11):872-874.