张雪梅， 王 瑞， 吴喜民， 王新宏， 高文运， 李医明*

(1.上海中医药大学，上海201203;2.西北大学，陕西 西安710069)

玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有凉血滋阴，泻火解毒的功效［1］，为传统常用中药。化学研究表明玄参中含有多种环烯醚萜类成分如哈巴苷、哈巴俄苷、8-O-阿魏酰基哈巴苷、8-O-(2-羟基肉桂酰基)哈巴苷、6-O-α-D-半乳糖基哈巴俄苷、6′-O-乙酰哈巴苷等［2-4］，药理研究表明这些成分具有抗炎、抗菌、抗氧化、保肝等多种活性［5-9］，因而对玄参中环烯醚萜类成分进行质量控制十分必要。目前对玄参中环烯醚萜类成分的含量测定应用较多的是HPLC方法，且主要集中在哈巴苷和哈巴俄苷，由于玄参中还存在大量其它环烯醚萜类成分，而这些成分目前没有标准品，因而HPLC方法目前还不能很好的测定玄参中总环烯醚萜类成分的含量。为了更好的测定玄参中总环烯醚萜类成分的含量，本试验首先对文献报道的萜类化合物的显色方法，如 Trim-Hill、Shear、Epstahl及 5%香兰素冰醋酸显色反应［10-12］进行筛选，确定针对玄参中环烯醚萜类成分的显色方法，然后对此方法用正交实验进行了优化，用于玄参中总环烯醚萜类成分的含量测定，获得了较为满意的结果，现报道如下:

1 仪器与试药

D1901紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，1 cm比色皿，SB-1000恒温水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)，XS205DU电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，SK5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

Trim-Hill试剂(冰醋酸10 mL、0.2%硫酸铜水溶液 1 mL、浓硫酸 0.5 mL 混合)［10］，Shear试剂(盐酸∶苯胺 =1 ∶15 的混合液)［10］，Epstahl试剂(对二甲氨基苯甲醛0.25 g，冰醋酸50 g，85%磷酸5 g，水20 mL 混合)［10］，5% 香兰素冰醋酸［11］，冰醋酸，磷酸，高氯酸，盐酸，硫酸，上述试剂均为分析纯，水为去离子水。

哈巴俄苷(批号111730-200605)标准品购于中国药品生物制品检定所。对照品哈巴苷，8-O-阿魏酰基哈巴苷，8-O-(2-羟基肉桂酰基)哈巴苷，6-O-α-D-半乳糖基哈巴俄苷，6′-O-乙酰哈巴苷均为自行分离精制，并经1HNMR、13CNMR鉴定结构，HPLC检测，面积归一化法计算纯度均大于98%。实验所用玄参(批号20091016)购自上海养和堂中药饮片厂，于55℃烘干，粉碎，过三号筛，备用。

2 溶液制备

2.1 对照品溶液

精密称取哈巴俄苷对照品适量，加50%甲醇水溶液配置成浓度为0.100 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液

取玄参粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，称定重量，浸泡1 h，超声处理(功率200 W，频率53 kHz)45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

3 显色条件

3.1 显色方法的确定

Trim-Hill试剂能与玄参中环烯醚萜类成分如哈巴苷、哈巴俄苷、8-O-阿魏酰基哈巴苷、8-O-(2-羟基肉桂酰基)哈巴苷、6-O-α-D-半乳糖基哈巴俄苷、6′-O-乙酰哈巴苷等反应，产生紫红色，但显色所需时间太长。

Shear试剂和Epstahl试剂能与上述环烯醚萜类成分产生特有的颜色，但是反应缓慢，易于变浑浊，难以进行定量，仅适宜定性研究。

5%香兰素冰醋酸与上述环烯醚萜类成分反应灵敏迅速，产生的紫红色产物稳定，经比色法观察1 h内吸收度变化范围小于0.79%，符合定量分析要求。

3.2 测定波长的确定

在酸性催化条件下，5%香兰素冰醋酸能与上述环烯醚萜类成分发生化学反应，使之产生明显的紫红色。该反应能定量进行，生成的有色产物在60 min内基本保持稳定，且玄参中其他成分如苯丙素、多糖等对其干扰小。由吸收光谱图可见，该类化合物的最大吸收波长在528 nm，实验采用此波长为测定波长。

3.3 酸催化剂种类的选择

酸催化是影响此显色反应的重要因素，故本实验以哈巴俄苷为对照品对酸的种类进行了选择，结果见表1。

实验结果表明，高氯酸和磷酸反应不完全，显色效果差，盐酸和硫酸催化效果均较好，但硫酸反应稳定，显色灵敏，综合考虑选用硫酸做催化剂。

表1 酸催化剂种类的选择(λ=528 nm)

3.4 显色条件的选择—正交实验

对5%香兰素冰醋酸显色反应研究表明，影响显色的因素有4个，即显色剂用量、显色时间、显色温度和硫酸用量等。本实验以哈巴俄苷为对照品，应用正交实验表L9(34)对影响显色的因素进行实验优化，结果见表2。

以吸光度为考察指标，极差值显示，各因素作用主次为A＞D＞C＞B;方差分析结果表明:A、D因素的影响均有显著性意义。综合上述两项考察指标，优化水平组合应为A3B1C3D3，即取对照品溶液0.5 mL置于试管中，依次加入0.4 mL 5%香兰素冰醋酸，1.2 mL硫酸，3 mL冰醋酸，于水浴锅中60℃下加热15 min进行显色。

表2 实验因素水平

表3 正交实验结果

表4 方差分析结果

3.5 最佳显色条件的验证实验

取0.030 mg/mL的哈巴俄苷对照品溶液6份，按最佳显色条件平行操作，测定吸光度值分别为0.338，0.329，0.346，0.356.，0.340，0.329，表明本最佳显色条件合理，而且具有较好的稳定性。

4 玄参中环烯醚萜类成分的含量测定

4.1 线性关系考察

精密量取2.1项下对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，加50%甲醇水定容至10 mL，摇匀。再取上述不同浓度的对照品溶液0.5 mL，按最佳显色条件操作，以试剂空白为参比测定吸光度，得到如下回归方程:

式中Y为吸光度(AU)，X为溶液中哈巴俄苷的浓度(mg/mL)，该方程在所测范围内(0.010～0.040 mg/mL)线性关系良好。

4.2 精密度实验

取0.025 mg/mL的哈巴俄苷对照品溶液0.5 mL，按最佳显色方法操作，测定吸光度。结果:RSD=0.12%(n=6)，表明本法精密度良好。

4.3 稳定性实验

按2.2项下制备样品溶液，取0.5 mL按最佳显色方法操作，测定吸光度，每隔10 min测定1次。结果1 h内测得吸光度的RSD=0.79%(n=7)，表明样品溶液在1 h内基本稳定。

4.4 重复性实验

按2.2项下制备样品溶液，取0.5 mL按最佳显色方法操作，测定吸光度。结果:RSD=2.56%(n=6)，表明本法重现性良好。

4.5 回收率实验

精密称取已测知含量的样品(含量为2.968%)，分别加入一定量的哈巴俄苷对照品，制备成样品溶液，测定吸光度，计算回收率，结果见表5。

表5 加样回收率(n=9)

4.6 样品的测定

按2.2项下制备样品溶液，取0.5 mL按最佳显色方法操作，测定吸光度，计算玄参中总环烯醚萜类成分的含量，其结果见表6。

表6 不同产地玄参总环烯醚萜类成分的含量

11个产地样品中环烯醚萜类成分的含量在1.910%～3.446%之间，其中浙江产玄参总环烯醚萜类成分含量较高，山东产玄参总环烯醚萜类成分含量则较低。各产地气候、土壤等环境条件是影响含量的重要因素。

5 结论

通过上述研究说明，紫外可见分光光度法适合玄参中总环烯醚萜类成分的含量测定。由于方法简单，对仪器的要求低，结果可靠，此方法可在医药企业特别是原药材产地作为控制药材质量的方法。

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