娄丽，高学军，敖金霞

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

益生菌是近年来开发的一种新型饲料添加剂，在畜禽生产中具有广阔的应用前景［1］。对畜禽而言，饲料的营养价值是由必需氨基酸决定的，其中最重要的是蛋氨酸。如果缺乏蛋氨酸，可导致产奶量降低等。当前国内外对枯草芽胞杆菌研究并不多，但是大多数研究者对枯草芽胞杆菌的作用效果表示认可。枯草芽胞杆菌做为益生菌之一，已广泛用于生产，它比其他益生菌具有更多的优点，有增进畜禽生长性能，又有较强的抗性，在饲料制粒和储存过程以及在胃肠道中作用稳定并保持较高活性［2］。玉米胚乳中玉米醇溶蛋白(zein)是天然存在的稳定型蛋白，含有20%的蛋氨酸。由于它富含蛋氨酸的特点，在国际上广泛应用，已经在许多转基因植物例如转基因大麦中［3-4］成功表达，并提高了蛋氨酸含量。高蛋氨酸蛋白基因在微生物中，尤其是在枯草芽胞杆菌中是否可以表达，尚未见报道。本实验研究zein基因在枯草芽胞杆菌中表达，为制备富含蛋氨酸枯草芽胞杆菌进一步应用于饲料生产提供工作基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料Bacillus subtili WB600、玉米种子(农大108)由本实验室保存。

1.1.2 试剂E.coli TOP10、RNAiso-mate for Plant Tissue、Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、蛋白质Marker、SmaⅠ、XbaⅠ、DNA marker购自大连宝生物科技有限公司;氨苄青霉素、氯霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自上海生工生物工程公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、枯草芽胞杆菌表达载体pHT43购自Axygen公司;引物由北京英俊公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 玉米胚乳中总RNA的提取反转录成cDNA。用Trizol法提取玉米胚乳中的总RNA。cDNA的合成采用试剂盒方法(见宝生物Prime-Script RT-PCR Kit说明书)。

1.2.2 zein的PCR扩增根据NCBI上zein的cDNA全序列设计引物［5］，为方便连接，在上游引物5'端添加XbaⅠ酶切位点，在下游引物5'端添加SmaⅠ酶切位点。上游引物：5'-TCTAGAAG GAAGCAAGGACACCACC-3'，下游引物：5'-CCCGGGTCTAGAATGCAGCACCAAC-3'。以cDNA为模板进行PCR反应，反应条件：95℃，5 min;94℃，1 min;56.5℃，30 s;72℃，30 s;72℃，7 min。扩增完毕后，取5 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检验PCR结果。

1.2.3 zein基因的克隆和序列测定将PCR扩增产物连接到pMD18-T simple载体上，转化大肠埃希菌TOP10感受态中，经氨苄筛选后，提取质粒，通过PCR鉴定，筛选阳性克隆子，将阳性克隆子进行核苷酸序列测定(由北京英俊公司完成)，用生物信息学软件将所得序列和NCBI发布的序列进行比对分析。

1.2.4 枯草芽胞杆菌中重组表达质粒的构建以及转化用XbaⅠ/SmaⅠ双酶切PCR扩增片段并从胶中回收，然后用T4连接酶与同样双酶切后胶回收的pHT43连接，构建成重组表达载体pHT43-zein。通过电转化方法将重组表达质粒转入Bacillus subtilis WB600中［6］。LB培养基中培养，氯霉素筛选。

1.2.5 枯草芽胞杆菌中重组表达质粒pHT43-zein的鉴定挑取单菌落于5 mL LB+氯霉素培养基中培养，提取质粒［7］，用SmaⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，筛选阳性克隆子。

1.2.6 pHT43-zein在枯草芽胞杆菌的表达将携带重组表达质粒pHT43-zein的枯草芽胞杆菌在含有氯霉素的LB培养基中培养至OD值为0.5～1.0之间时，加入0.8 mmol/L的IPTG，诱导24 h后，制取蛋白样，然后进行SDS-PAGE电泳，其浓缩胶浓度为5%，电泳时电压为80 V，分离胶浓度为12%，电压为110 V。电泳结束后，用固定液固定蛋白胶30 min，用考马斯亮蓝进行染色，经脱色液脱色后观察表达后产物条带。

1.2.7 HPLC检测菌液中蛋氨酸含量测定菌株中总蛋氨酸含量，取菌体8 mL，按照GB/T 18246-2000中酸水解法进行水解后，定容至50 mL。吸取1 mL滤液，分别置于50 mL离心管中，再分别吸取Na2CO3-NaHCO3pH 9.0缓冲液2 mL，混匀后，加入CDNB溶液各2 mL，混匀，经0.22 μm滤膜过滤后，取10 μL直接上样测定其中蛋氨酸含量。

2 结果与分析

2.1 玉米醇溶蛋白(zein)基因序列的获得

扩增出zein目的片段见图1，在500 bp处出现目的带，与预期的大小相符，经测序该片段全长476 bp与NCBI报道序列进行Blast分析，同源性达到了99%，在157、430位置处出现了错配。

图1 玉米醇溶蛋白基因的PCR产物电泳图谱Fig.1 PCR products of zein gene of Psophocarpus tetragonolobus

2.2 枯草芽胞杆菌中重组表达载体的构建和鉴定

重组质粒pHT43-zein，片段长为8 524 bp，见图2。将重组质粒转化到枯草芽胞杆菌中，提取阳性克隆子，进行双酶切鉴定，如图3，在500 bp出现条带，条带大小符合预测值，证明重组表达载体的质粒已经成功转入到枯草芽胞杆菌中。

2.3 目的蛋白的SDS-PAGE鉴定

图4 蛋白电泳检验枯草芽胞杆菌中的目的蛋白Fig.4 SDS-PAGE detection of zein in Bacillus subtilis

将未诱导、诱导的含空载体pHT43的重组菌和含重组质粒的重组菌按5%(体积比)分别接种于100 mL摇瓶发酵培养基(含氯霉素)中，37℃200 r/min振荡培养4 h后，加入终浓度0.8%的IPTG诱导，24 h后终止，离心取沉淀进行SDSPAGE，与对照相比，含重组质粒的重组菌沉淀在26 ku附近出现了蛋白条带，与预测的大小相符，如图4。

2.4 枯草芽胞杆菌发酵液中蛋氨酸含量测定的结果

蛋氨酸标准品衍生液HPLC结果见图5，根据标准品各个浓度的峰面积制作标准曲线见图6，给出回归方程。Bacillus subtilis的HPLC检测结果和重组菌的HPLC检测结果见图7、图8。重组菌的蛋氨酸含量是0.47 μg/mL，野生菌的蛋氨酸含量是0.39 μg/mL，结果重组菌蛋氨酸含量比野生菌提高了20.51%(n=5)。

3 讨论

本实验所用的zein是富含蛋氨酸蛋白的基因，从它的氨基酸序列可知蛋氨酸的含量为20%。通过基因工程的方法将其转入到枯草芽胞杆菌中，从而使枯草芽胞杆菌中蛋氨酸含量提高了20.51%。益生菌中枯草芽胞杆菌现如今作为宿主已经成功表达了很多种类的基因［8-16］，但将植物中zein转入到益生菌枯草芽胞杆菌中还属首例。本实验成功地在枯草芽胞杆菌中表达了植物来源的富含蛋氨酸基因，下一步的研究就是要实现更高效的表达。本研究为今后开展该基因在益生菌中高效表达并应用于饲料添加剂方面提供了重要工作基础。

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