周旭春（重庆医科大学附属第一医院消化内科，重庆市 400016）

笔者前期研究发现，过高或过低蛋白质摄入都将促进腺泡细胞结构的破坏，加速酒精性胰腺损伤的进程[1]。姜黄素（Curcumin）是从姜黄中提取的一种多酚类色素，有广泛的药理作用。其在抗炎、肿瘤预防和治疗上近年都备受关注[2]。已有研究发现，姜黄素对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞的损伤有保护作用[3]，但其对酒精联合过高、过低蛋白质摄入造成的胰腺损伤的作用如何尚未见文献报道。为此，笔者对其进行研讨，以期为姜黄素的临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CKX41型光学显微镜（日本Olympus公司）；5810R型高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；M2e型多功能酶标仪（重庆迈克科技公司）；AUW120D型电子天平（日本岛津公司）；600型电子显微镜（日本Hitach公司）。

1.2 试药

姜黄素（生工生物工程（上海）有限公司）；环氧化酶-2（COX-2）羊单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；TUNEL试剂盒（美国Roche公司）；淀粉酶检测试剂盒（上海科华-东菱诊断用品有限公司）；脂肪酶检测试剂盒（德国GmbH公司）。

1.3 动物

清洁级Wistar大鼠30只，♂，体重80～110 g，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SCXK（渝）20070001）。

2 方法

2.1 复制模型

Wistar大鼠总热量供给相同，脂肪含量占总热量供给的25%，随机分组如下：正常对照组，正常饲养；酒精组，以25%酒精代替饮水自由饮用，其中又随机分为高蛋白（蛋白质占总热量供给的32%）、高蛋白+姜黄素（蛋白质占总热量供给的32%，ig姜黄素300 mg·kg-1）、低蛋白（蛋白质占总热量供给的6%）、低蛋白+姜黄素（蛋白质占总热量供给的6%，姜黄素300 mg·kg-1）组。

各组大鼠其他矿物质和微量元素摄入相当，每组6只，分别喂给上述特种饲料6个月，实验结束时处死大鼠，称重，取出胰腺组织。

2.2 光镜下观察胰腺组织形态学变化

取少量胰腺组织固定于10%中性甲醛缓冲液中，HE染色，由专业病理医师观察切片。

2.3 电镜下观察胰腺腺泡细胞超微结构

切取火柴头大小的胰腺组织，2.5%戊二醛固定，制片后于电镜下观察胰腺腺泡细胞超微结构的改变。

2.4 胰腺外分泌功能检测

取部分胰腺组织制成组织匀浆，以3 000 r·min-1离心，取上清液，分别检测每1 mL胰腺组织匀浆中的淀粉酶和脂肪酶含量。

2.5 大鼠胰腺组织细胞凋亡检测（TUNEL法）

取胰腺组织制成的石蜡切片，二甲苯脱蜡，微波炉修复抗原，蛋白酶K作用30 min，其余步骤按试剂盒说明书进行。最后在光镜下观察，细胞核染色呈棕黄色，为凋亡细胞。凋亡指数（AI）计算方法：在高倍视野（400×）下，选择5个视野分别计数200个细胞，分别计数凋亡细胞和总细胞数（AI＝凋亡细胞数/总细胞数×100%）。

2.6 胰腺组织切片COX-2表达的检测

取胰腺组织制成的石蜡切片，二甲苯脱蜡，微波炉修复抗原，0.3%H2O230 min去除内过氧化酶，PBS洗涤，正常血清室温封闭30 min，分别滴加工作浓度为1∶100的羊抗50 μL，细胞浆染成棕黄色为COX-2表达阳性。结果以图像分析仪作积分光密度量化处理。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 体重的称定

高蛋白、高蛋白+姜黄素、低蛋白、低蛋白+姜黄素、正常对照组大鼠体重分别为（260±25）、（275±30）、（250±23）、（263.5±19）、（253.5±15.0）g，各组间比较无显著性差异。

3.2 病理形态学的改变

3.2.1 腺泡细胞显微结构的改变 HE染色显示，高、低蛋白组胰腺腺泡细胞内可见脂肪空泡，腺泡细胞充血水肿；2组在加用姜黄素后，腺泡细胞充血水肿有所减轻。但各组胰腺组织显微结构无显著性差异，故图片略去。

3.2.2 腺泡细胞超微结构的改变 各组大鼠胰腺腺泡细胞均有不同程度的损伤。高蛋白组大鼠的胰腺腺泡细胞线粒体普遍肿胀，体积增大，基质内出现多个亮区，基质颗粒减少，嵴少，细胞内脂滴增加，酶原颗粒减少，髓样结构形成。高蛋白+姜黄素组腺泡细胞内肿胀线粒体数量减少，酶原颗粒增加，髓样结构减少。进食高蛋白饲料的所有大鼠胰腺腺泡细胞粗面内质网均无明显改变。低蛋白组线粒体肿胀，粗面内质网扩张，可见髓样结构形成，部分细胞溶解坏死。低蛋白+姜黄素组线粒体肿胀减轻，髓样结构减少，未见细胞溶解坏死。胰腺腺泡细胞超微结构的改变见图1。

3.3 胰腺外分泌功能的改变

图1 胰腺腺泡细胞超微结构的改变（6 000×）A.高蛋白组；B.高蛋白+姜黄素组；C.低蛋白组；D.低蛋白+姜黄素组Fig 1Ultra-microstructure of pancreatic acinar cel（l6 000×）A.high protein group；B.high protein+curcumin group；C.low protein group；D.low protein+curcumin group

无论摄入高蛋白、低蛋白饲料，加用姜黄素后，胰腺组织匀浆淀粉酶、脂肪酶含量均较未用姜黄素时有所增加，其中高蛋白+姜黄素组胰腺组织匀浆淀粉酶和脂肪酶较高蛋白组显著增加（P＜0.05），低蛋白+姜黄素组脂肪酶较低蛋白组显著增加（P＜0.05）。大鼠胰腺组织匀浆淀粉酶、脂肪酶的改变见表1。

表1 大鼠胰腺组织匀浆淀粉酶、脂肪酶的改变（±s）Tab 1 Changes of lipase and amylase in pancreatic tissue homogenat（e±s）

表1 大鼠胰腺组织匀浆淀粉酶、脂肪酶的改变（±s）Tab 1 Changes of lipase and amylase in pancreatic tissue homogenat（e±s）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与高蛋白组比较：#P＜0.05；与低蛋白组比较：△P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.high protein group：#P＜0.05；vs.low protein group：△P＜0.05

脂肪酶/U·g-1 10 193.06±206.27 263.16±15.22＊798.43±28.68#111.67±8.87＊163.89±9.90△分组正常对照组高蛋白组高蛋白+姜黄素组低蛋白组低蛋白+姜黄素组淀粉酶/U·g-1 6 532.87±100.11 364.49±15.09＊423.31±20.66#91.67±6.53＊103.42±10.32△

3.4 细胞凋亡检测结果

与正常对照组比较，高、低蛋白组AI均显著升高（P＜0.01）；与高蛋白组比较，高蛋白+姜黄素组AI显著降低（P＜0.05）；与低蛋白组比较，低蛋白+姜黄素组AI显著降低（P＜0.05）。细胞凋亡检测结果见表2。

3.5 COX-2检测结果

经图像分析检测得高蛋白组、高蛋白+姜黄素组、低蛋白组、低蛋白+姜黄素组光密度值分别为（0.13±0.03）、（0.08±0.02）、（0.22±0.03）、（0.14±0.06），表明加用姜黄素后，高、低蛋白组大鼠胰腺腺泡细胞胞浆COX-2的棕黄染色均变浅。胰腺腺泡细胞COX-2的表达见图2。

4 讨论

表2 细胞凋亡检测结果（±s）Tab 2 Results of detection of cell apoptosi（s±s）

表2 细胞凋亡检测结果（±s）Tab 2 Results of detection of cell apoptosi（s±s）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与高蛋白组比较：#P＜0.05；与低蛋白组比较：△P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.high protein group：#P＜0.05；vs.low protein group：△P＜0.05

分组正常对照组高蛋白组高蛋白+姜黄素组低蛋白组低蛋白+姜黄素组AI/%0.31±0.1 2.1±0.1＊1.5±0.3#6.6±1.0＊4.3±0.5△

图2 胰腺腺泡细胞COX-2的表达（200×）A.高蛋白组；B.高蛋白+姜黄素组；C.低蛋白组；D.低蛋白+姜黄素组Fig 2 Expression of COX-2 in pancreatic acinar cell（200×）A.high protein group；B.high protein+curcumin group；C.low protein group；D.low protein+curcumin group

慢性胰腺炎是以胰腺实质发生慢性持续性炎性损害、纤维化和可能导致的胰管扩张、胰管结石或钙化等不可逆性的形态改变为其特征，可引起顽固性疼痛和永久性内、外分泌功能丢失[4]的炎症疾病。流行病学调查显示，酒精是慢性胰腺炎最主要的病因。但前人动物实验研究发现，长期饮酒并未造成典型的慢性胰腺炎的病理改变。笔者前期研究发现，长期饮酒仅造成大鼠胰腺的外分泌功能减退，但胰腺的显微结构却无显著性改变，胰腺腺泡细胞的超微结构可见髓样结构形成，呈慢性胰腺腺泡细胞退行性改变[5]。有研究认为，慢性胰腺腺泡细胞退行性改变可能是酒精性慢性胰腺腺泡细胞损伤的早期改变。

本研究中，给大鼠喂饲姜黄素后，大鼠胰腺腺泡细胞的显微结构虽无特别的变化，但无论高蛋白组还是低蛋白组其超微结构均发生了不同程度的改变，表现为线粒体肿胀减轻，髓样结构减少，胰腺腺泡细胞的凋亡减少，胰腺组织的淀粉酶和脂肪酶的含量均较正常对照组有不同程度的升高，提示使用姜黄素后胰腺腺泡细胞的退行性改变有改善。

姜黄素是一种多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小。近年研究发现，姜黄素具有某些非甾体类抗炎药物的特性，可抑制COX-2的表达。COX-2是调节花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，是炎症性损伤的一个标志物[6，7]。笔者前期研究已发现酒精性胰腺损伤时COX-2的表达增加，其表达与胰腺腺泡细胞的损伤程度有关，胰腺腺泡细胞的损伤越轻，COX-2的表达越低[7]。慢性炎症时COX-2的表达增加，抑癌基因失活，COX-2的表达与胰腺癌的发生有关[8]。本研究中姜黄素对高、低蛋白组COX-2的表达均有不同程度的抑制。因此，笔者推测姜黄素可能通过抑制COX-2的表达，来减少胰腺腺泡细胞凋亡，改善胰腺腺泡细胞退行性改变。

总之，本研究观察了姜黄素对过高、过低蛋白质联合慢性酒精摄入所致的胰腺腺泡细胞退行性病变的影响，发现姜黄素可减轻胰腺腺泡细胞的退行性改变，此作用可能与抑制COX-2的表达有关。由于COX-2的表达与胰腺腺泡细胞的损伤和胰腺癌的发生有关，因此在酒精致胰腺腺泡细胞退行性改变、慢性胰腺炎的过程中，间歇使用姜黄素，对这一漫长过程的各个阶段可能均有修复和减缓发展的作用，有利于预防和治疗慢性胰腺炎、胰腺癌。

[1] 周旭春，唐承薇，刘纯伦.蛋白质摄入量在酒精性胰腺损伤中的作用[J].胰腺病学，2006，6（2）：69.

[2] Julie SJ.Anti-inflammatory properties of curcumin，a major constituent of curcuma longa：a review of preclinical and clinical research[J].Alternative Medicine Review，2009，14（2）：141.

[3] Gulcubuk A，Altunatmaz K，Sonmez K，et al.Effects of curcumin on tumour necrosis factor-alpha and interleukin-6 in the late phase of experimental acute pancreatitis[J].J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med，2006，53（1）：49.

[4] 中华医学会外科学分会胰腺外科学组.慢性胰腺炎诊治指南（讨论稿）[J].中国实用外科杂志，2009，29（1）：1.

[5] 周旭春，唐承薇，刘纯伦.长期乙醇摄入导致胰腺腺泡细胞退行性改变[J].中华消化杂志，2005，25（5）：284.

[6] Ozhan G，Yanar TH，Ertekin C，et al.The effect of genetic polymorphisms of cyclooxygenase 2 on acute pancreatitis in Turkey[J].Pancreas，2010，39（3）：371.

[7] O'Brien G，Shields CJ，Winter DC，et al.Cyclooxygenase-2 plays a central role in the genesis of pancreatitis and associated lung injury[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2005，4（1）：126.

[8] Song Z，Bhagat G，Quante M，et al.Potential carcinogenic effects of cigarette smoke and Swedish moist snuff on pancreas：a study using a transgenic mouse model of chronic pancreatitis[J].Lab Invest，2010，90（3）：426.